PPD批次与注射方式对PPD皮内变态反应检疫的影响

张家瑞， 张 力， 屈勇刚*， 连晓春， 李 静， 常军帅， 李 岩*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，乌鲁木齐 830063)

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性人兽共患病。各国通常采用检疫和扑杀的策略来防控牛结核病。但当检疫中出现假阳性牛被扑杀的情况时便会造成巨大的经济损失。因此，人们开始对造成检疫结果出现假阳性的原因进行调查研究[1]。曾有人研究发现由于规模化养殖的牛群每年需要进行PPD皮内变态反应检疫牛结核病，并且在多次接种PPD时常会出现使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情况，这时就可能会对PPD皮内变态反应检疫造成影响[2]。为此，人们对干扰PPD皮内变态反应检疫的影响因素进行了许多相关研究。其中，关于混用不同批次PPD进行牛结核病复检时对PPD皮内变态反应检疫结果判定是否产生干扰的公开数据是相互矛盾的，同时也缺乏对牛只进行复检时多次皮下接种PPD是否会产生影响的相关数据[3]。另外，由于牛模型存在材料昂贵、操作不便等限制，使得进行该类研究的难度大大增加，因此对牛分枝杆菌同样敏感，迟发型变态反应也非常强烈的豚鼠模型被重新利用起来[4]。本研究首次利用豚鼠作为动物模型探究在牛结核病检疫中出现的使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情况是否会对检疫结果的判定造成干扰，以为建立更简单、安全、可靠的牛结核病检测与净化方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品

结核菌素提纯蛋白衍化物(PPD)(规格：50头份/瓶，批号：201003、201801)由哈药集团生物疫苗有限公司生产，皮试实验前用生理盐水稀释至50 IU/mL的皮试浓度。0.9%氯化钠注射液(规格：500 mL，4.5 g/瓶，批号：1908263B)由西安京西双鹤药业有限公司生产。

1.2 试验动物及分组

清洁级豚鼠24只，雌雄各12只，6～9周龄，饲养环境良好，自由采食和饮水。实验动物生产许可证号：SCXK(新)2020-0003。实验动物饲料生产许可证：苏饲证(2019)07014。均购自新疆医科大学医学实验动物中心。

24只豚鼠随机分为4组：标准参照组(同一批次PPD皮内注射，批号：201801)、皮内组(不同批次PPD皮内注射，批号：201003和201801)、皮下组(同一批次PPD皮下注射，批号：201801)和生理盐水组(0.9%氯化钠注射液)。

1.3 皮肤试验

参照《结核菌素提纯蛋白衍化物(PPD)制造及检定规程》中的“致敏作用试验”进行部分试验设计。豚鼠经7 d适应期后，在试验前对豚鼠一侧背部皮试区进行脱毛处理。皮试前应检查脱毛处皮肤是否存在外伤，若存在外伤将选择另一侧重新脱毛进行试验，并做好相关记录。标准参照组每只皮内注射0.1 mL(5 IU)的PPD(批号：201801)；皮内组交替注射2个批号的PPD(批号：201003和201801)；皮下组每只皮下注射0.1 mL(5 IU)的PPD(批号：201801)。生理盐水组每只皮内注射0.1 mL的0.9%氯化钠注射液。各组每隔2周进行1次皮试，并于每次皮试后24 h，48 h，72 h分别观察记录豚鼠皮试部位反应情况，共3次。在第3次注射的2周后所有豚鼠统一注射PPD(批号：201801)进行皮肤试验，并分别观察记录皮试后24 h，48 h，72 h皮试部位反应情况。

2 结果与分析

在本次试验中，阴性组所有豚鼠经0.9%氯化钠皮内注射后，注射处(↓)均可见豌豆样肿块，表明皮内注射成功。在试验各阶段均未观察到豚鼠皮试处出现明显异常和皮内变态反应。另在第3次皮试前发现部分豚鼠皮肤存在外伤，改为右侧重新脱毛进行试验，见图1。

注：A为皮内注射后0 h；B为第1次皮试72 h后；C为第2次皮试72 h后；D为第3次皮试72 h后；E为第4次皮试72 h后。下同。

2.1 标准参照组试验结果

试验结果显示，通过使用PPD(批号：201801)对标准参照组豚鼠进行皮内注射后，该组所有豚鼠注射处(↓)均可见豌豆样肿块，表明皮内注射成功。并于每次皮试后的24 h，48 h和72 h在皮试部位均未观察到局部红斑硬结，见图2。

图2 标准参照组皮肤试验结果

2.2 皮内注射不同批次PPD皮肤试验结果

对皮内组所有豚鼠进行皮内多次交替注射不同批次的PPD(批号：201003和201801)，注射后该组所有豚鼠注射处(↓)均可见豌豆样肿块，表明皮内注射成功。并于每次皮试后的24 h，48 h和72 h在皮试部位均未观察到局部红斑硬结，见图3。

图3 皮内组皮肤试验结果

2.3 皮下注射同一批次PPD皮肤试验结果

使用同一批次的PPD(批号：201801)通过皮下注射法对豚鼠进行皮试，该组所有豚鼠注射处(↓)均未见豌豆样肿块，表明皮下注射成功。另在第3次皮试前发现部分豚鼠皮肤存在外伤，改为右侧重新脱毛进行试验。并于每次皮试后的24 h，48 h和72 h在皮试部位均未观察到局部红斑硬结，见图4。

图4 皮下组皮肤试验结果

3 讨 论

牛结核病是一种关乎人类健康和食品公共安全的人畜共患病。在许多国家，始终认为基于检疫和扑杀的策略能够有效防控牛结核病[5]。在检疫中主要采用以细胞免疫为基础的检测方法，即PPD皮内变态反应试验。PPD皮内变态反应试验是目前被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)认可的监测和控制牛结核病的手段之一[6]。但随着规模化养殖中检疫的日益频繁，随之而来的关于在检疫中误杀假阳性牛的情况也变得日益严重。同时，由于规模化养殖的牛群每年多次接种PPD进行牛结核病检疫间隔较长，不能保证每次检疫都使用同一批次的PPD以及出现未严格按规范的要求进行皮内接种，而将PPD注射到皮下的情况。于是便有人质疑在PPD皮内变态反应检疫过程中使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等这类人为因素，可能会干扰PPD皮内变态反应检疫结果的判定[7]。同时，重复该类研究存在着试验动物的耗资大的问题。所以，人们开始选用一些高效低价的动物模型来降低成本。豚鼠便成为了评价和验证多种免疫试验的首选模型之一。由于豚鼠的迟发型变态反应强烈，常常被应用于结核相关检测生物制剂和新型检测方法的评价试验，同时也已成为PPD皮内变态反应试验效能评定的金标准[8]。

因此，本研究为了探究在牛结核病检疫中出现的使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情况是否会对检疫结果的判定造成干扰，选用同样可产生强烈迟发型变态反应的豚鼠作为试验模型，并参照《结核菌素提纯蛋白衍化物(PPD)制造及检定规程》中的“致敏作用试验”进行部分试验设计[9]。本试验通过对豚鼠背部经过多次皮内注射同一批次的标准结核菌素后观察到每次皮试后24 h，48 h和72 h均未出现迟发型变态反应，该试验结果同上述规程中的结果一致，证明使用质量合格的同一批次的PPD多次进行PPD皮内变态反应检疫时不会干扰检疫结果的判定。该结果与Gormley等人[10]的部分试验结论相符合，对人工感染牛分枝杆菌前的牛只进行多次颈部皮内变态反应检测时，虽然会在皮试试验期间出现皮厚差稍有增加的情况，但与整个试验的结果比较无差异。

本研究中使用同一厂家不同批次的结核菌素交替皮内接种豚鼠后观察到每次皮试后24h，48 h和72 h均未出现迟发型变态反应，该结果与标准参照组皮试结果无差异。同时也与王宏伟等人[11]的研究结论相符合，其试验通过对不同厂家的牛型提纯结核菌素进行一系列临床研究，其结果显示两种出产自不同厂家的PPD具有较高阳性符合率，阴性符合率甚至达到了100%，间接证明了PPD的批次不是干扰检测结果判定的因素。但也有与本试验结果存在差异的报道，如卫龙兴等人[12]通过采用同一厂家的不同批次的结核菌素对存在自然感染的牛群进行结核菌素皮内变态反应后，研究发现使用不同批次PPD进行的皮内变态反应结果差异显著。该试验结论虽与本试验结果有所不同，但均未出现假阳性的情况。依然表明了使用不同批次的PPD进行PPD皮内变态反应检疫时不会对检疫结果判定造成影响。

与此同时，本试验还进行了多次皮下注射同一批次的PPD，试验结果表明多次皮下注射PPD不会引起豚鼠产生特异性迟发型变态反应，该结果与标准参照组皮试结果无差异。本试验结果同时与Victoria等人[13]的验证试验结果相符合，其研究通过对感染过分枝杆菌的儿童同时进行皮内和皮下注射结核菌素，试验发现在同一试验个体的两处皮试处产生的迟发型变态反应强度无差异，说明结核菌素皮内变态反应试验的注射途径不会干扰变态反应的结果判定。

Coad等人[14]还在自然感染牛分枝杆菌的牛中发现，短时间内重复进行皮肤试验可能导致皮肤试验反应性的逐步降低，这对检测存在不确定性的感染动物具有潜在的负面影响。对于假阴性的干扰，由于本研究现阶段存在诸多方面的限制，只能在往后的试验中再进行研究。