簇生稻穗发育及细胞周期相关基因的表达分析

陈丽萍，蒋家焕，郑燕梅，朱永生，王颖姮，林 强，谢鸿光，罗 曦，蔡秋华，谢华安 ，张建福

（1. 福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350018；2. 农业农村部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州（国家）水稻改良分中心/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地，福建 福州 350003；3. 水稻国家工程实验室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意义】水稻是全世界重要粮食作物之一，也是我国最主要的粮食作物。穗是水稻产量形成的关键部位，穗型是影响水稻产量的一个重要因素，穗粒数的增加可以直接提高水稻的产量，目前通过常规途径来增加穗粒数和穗密度实现增产已有较大难度。簇生穗（Clustered Spikelets）是水稻穗部形成2～3粒籽粒簇生的一种异常现象，是水稻穗部的一种突变，有杂交变异和理化诱变等多种来源途径，将簇生稻（也称为复粒稻、麦粒稻）的簇生性状转育到正常单粒稻中，能有效缩短穗长并增加其穗粒数和着穗密度，对创造簇生稻新材料及提高产量等都具有重要意义[1−2]。【前人研究进展】簇生穗通常表现为枝梗顶端同时着生2～3粒颖花，大多数为3粒，形状呈“W”形排列[3]。美国科学家Jodon在1957年发现首个水稻主穗轴和一次枝梗顶端都着生2～3朵颖花的簇生穗突变体，此后又有多位学者对不同的水稻簇生穗材料进行了遗传学分析，发现水稻簇生穗突变体主要归结于两类，一类是多数枝梗中下部位簇生2个或2个以上小穗，称为枝梗小穗簇生突变体，定位于4号染色体上；另一类为枝梗顶端着生2～3粒籽粒的簇生穗突变体，定位于6号染色体上[4−8]。Jiang等[9]首次从一个9311簇生穗突变体中成功克隆了位于6号染色体上的簇生穗调控基因sped1-D，其编码一个三角状五肽重复蛋白，可能通过阻断RFL、Lax、WOX3等穗发育相关基因来缩短小花花梗和次级枝梗长度，并影响水稻小花花粉育性。同年，Guo等[10]也在9311遗传背景下克隆了位于4号染色体上的簇生穗调控基因CL4，其编码一个假定的细胞色素P450蛋白CYP724B1，该蛋白参与油菜素内酯的生物合成。Sped1-D和CL-4得以成功克隆与研究，使得我们对簇生穗基因的生物学功能有了初步的了解，但其具体的分子机理仍有待进一步阐明。植物中常常存在一个基因可影响许多性状的发育而引起多方面表型效应的现象，并且单个性状的发育也通常是由多个基因控制的一系列生化过程连续作用的结果。前人研究表明，水稻中常常存在多个基因共同对穗发育的某个节点起调控作用最终导致穗发育的异常：如OsMFT1通过抑制FZP和5个SEPALLATA-like基因的表达致使分枝分生组织向小穗分生组织的转变被延迟，从而产生更多的穗分枝[11]；Gnp4通过与LAX相互作用一起参与调控水稻分生组织，从而控制水稻二次枝梗侧颖花形成及籽粒长度[12]。GL3.1通过影响细胞周期蛋白CycT1;3的磷酸化来控制水稻籽粒大小和产量[13]。细胞的发育需要通过精确、保守的机制对细胞周期进行适当的执行和调控。真核生物细胞周期进程调控的分子机制是高度保守的,细胞周期调节因子包括细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂（CDK inhibitors，CKIs）、成视网膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）同系物和E2F转录因子等在细胞周期控制、转录调控、DNA损失修复等有关肿瘤形成的过程中有重要作用[14]。动物中细胞周期调节因子失调常常导致细胞增殖异常，形成肿瘤。植物中细胞周期相关基因发生变异也常常导致其小穗、花器官发育异常。多花小穗突变体mfs1小穗分生组织转变到花分生组织延迟，出现一个额外的类颖壳器官和一个伸长的小穗轴，且护颖和内稃退化[15]。KRP1在水稻种子形成过程中从细胞有丝分裂周期脱离时发挥重要作用，其过表达植株种子灌浆明显降低[16]。细胞周期蛋白OsSDS的过表达突变体在营养生长阶段与野生型没有显著差异，但在生殖生长阶段却表现出雌雄配子均无活性、小穗完全不育[17]。【本研究切入点】相比于水稻正常穗在枝梗上的单粒着生，簇生穗是穗部的一种突变，属于发育缺陷，目前2个已克隆的簇生穗基因都是独立进行研究的，具体的调控机理仍不够清楚。在前期工作中，我们以簇生穗品种内江P164和单粒稻品种9311为亲本构建定位群体，最终将簇生穗基因精细定位到6号染色体上，定位区间内包含已克隆的簇生穗基因sped1-D的等位基因但变异位点不同，命名为OsCl-6[18]，簇生穗突变体主要表现为二次枝梗的数目及长度异常，目前已有不少基因被报道与二次枝梗发育及二次枝梗向花器官转变相关，但这些基因与簇生穗调控基因是否有直接关联也尚未见深入的研究。【拟解决的关键问题】本研究旨在通过qRT-PCR技术对簇生穗材料内江P164与单粒稻材料9311中枝梗发育相关基因及细胞周期相关基因的表达进行分析，探索簇生稻中穗发育相关基因及细胞周期相关基因在表达量上的关联，进一步深入对簇生穗基因的了解，为高产水稻品种选育提 供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

内江P164（Oryza sativa. Ssp. indica）为来自四川省农业科学院的一个簇生穗自然突变体。9311（Oryza sativa. Ssp. indica）为江苏里下河地区农业科学研究所选育的单粒稻籼稻品种。分别在2019年正季种植于福建福州水稻所网室大田及2019年晚季种植于南靖基地大田。

1.2 水稻RNA提取及反转录

水稻幼穗RNA提取采用天漠公司的ZR Plant RNA MiniPrep试剂盒。

1.3 qRT-PCR分析

qRT-PCR使用Vazyme的SYBR qPCR Master Mix，20 μL反应体系，反应混合液的组分与体积分别为：ROX Mix （2 x） 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol·L−1）各0.6 μL，cDNA 2 μL，剩余体积用ddH2O补足。以水稻actin基因（Os03g0718150）作为内参。qRTPCR得到的结果用相对定量的方法进行分析[19]。

2 结果与分析

2.1 9311和内江P164的农艺性状统计

为了更好地了解内江P164和9311的生长特性，对2019年晚季种植于南靖基地大田的簇生穗品种内江P164和单粒稻9311的农艺性状进行统计。统计结果发现，相比于9311，簇生穗品种内江P164的株高和穗长大于9311，一次枝梗数、二次枝梗数、主穗粒数和着粒数密度均低于9311，内江P164的穗发育异常主要体现在二次枝梗长度缩短且数目减少（表1）。

表 1 9311和内江P164的农艺性状比较Table 1 Agronomic characteristics of 9311 and Neijiang P164

2.2 幼穗发育不同时期OsCl-6的表达量分析

目前国际上公认的水稻花序发育过程分为9个时期，在第1～5时期表达的基因主要影响花序的枝梗发育，而在第6～9时期表达的基因则影响颖花的形成[20]。从内江P164的簇生穗形态上判断，一次枝梗发育并无明显异常，而二次枝梗则较短且较少。为了更清楚地检测OsCl-6在穗发育不同时期的表达情况，分别取种植于网室大田的9311和内江P164的如下几个时期的幼穗：（1）spl1：主穗轴形成期，茎顶端还未见白须尖，（2）spl2-4：一次枝梗原基形成和伸长期，茎顶端略见些许毛茸茸，幼穗长度小于2 mm，（3）spl5-6，茎顶端明显毛茸茸，幼穗长度约2～5 mm，（4）spl7-8：幼穗长度为1～2 cm，分别进行RNA提取、cDNA反转录及qRT-PCR分析。qRT-PCR结果显示，簇生穗基因OsCl-6在幼穗发育过程中表达量先有一个逐步上调的过程，在二次枝梗形成和分化的第5～6阶段表达量达到最高，随后表达量开始下调，且在所取的幼穗发育4个时期中的表达量在内江P164中均显著高于93-11（图1），这预示簇生稻内江P164的二次枝梗发育异常很可能直接受OsCl-6的表达量调控，OsCl-6的表达量显著上调或直接抑制其二次枝梗发育。

图 1 幼穗发育不同时期OsCl-6的表达量分析Fig. 1 Expression of OsCl-6 in young panicles at developmental stages

2.3 细胞周期相关基因的表达分析

由于内江P164和9311的穗形态差异主要体现在二次枝梗的长度和数目上，内江P164的二次枝梗缩短且数目明显较少，植物器官异常发育常常与细胞周期调控直接相关，为研究内江P164和9311中细胞周期关键基因的表达是否存在显著差异，本研究选取内江P164和9311的2～5 mm幼穗样品对28个细胞周期关键基因的表达量进行了qRT-PCR分析。结果显示，28个细胞周期关键基因中大部分基因的表达量都较高，这也预示着在幼穗发育时期中这些基因是高度活跃的，CAK1A、CDKA1、CDKC;2、CDKE和CDKF;1等细胞周期依赖激酶（CDKs）在9311中的表达高于内江P164，而CYCB2;1、CycB2;2和CycB1;1等B类细胞周期蛋白（cyclin）则在内江P164中的表达高于9311（图2）。CDKs是一组具有特征性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，协同周期蛋白cyclin，通过对丝氨酸/苏氨酸蛋白的化学作用驱动细胞周期，能在所有真核细胞中调控细胞周期的整个过程，其活性既受与之结合的cyclin的调节，又和特异的磷酸化和去磷酸化有关[14]。内江P164的簇生穗表型或受CDKs的表达量显著下调及B类cyclin的表达量显著上调直接调控。

图 2 幼穗中细胞周期相关基因的表达分析Fig. 2 Expressions of cell cycle-related genes in young panicle

2.4 穗发育相关基因的表达分析

植物中常常存在一个基因可影响许多性状的发育而引起多方面表型效应的现象，并且单个性状的发育也通常是由多个基因控制的一系列生化过程连续作用的结果。水稻中常常存在多个基因共同对穗发育的某个节点起调控作用最终导致穗发育的异常[11−13]。Jiang等[9]通过RT-PCR发现，相比于野生型9311，簇生穗突变体sped1-D中穗发育相关基因Lax1、OsWOX3、RFL、Rf-1L等的表达量均显著下调。为进一步探索簇生穗基因OsCl-6和水稻中其他穗发育尤其是枝梗发育相关基因的关系，我们分别对9311和内江P164的2～5 mm幼穗中与穗发育尤其是枝梗发育相关的基因的表达量进行qRT-PCR分析。分析结果表明，OsCl-6、MFS1、Rf-1L、OsREL2和CL-4等基因在幼穗中的表达量较高，而OsWOX3、RFL、Lax、Lax2、FZP和MFS2等基因则在幼穗中表达量较低，且OsWOX3、Lax1、FZP和MFS2在簇生穗材料内江P164的表达量显著低于9311，MFS1在簇生穗材料内江P164的表达量显著高于9311，而Rf-1L、OsREL2、RFL和Lax2的表达量在9311和内江P164无显著差异（图3）。因此OsCl-6或和上述表达量有显著差异的基因直接或间接的协同对水稻的枝梗发育起调节作用。

图 3 幼穗枝梗发育相关基因的表达分析Fig. 3 Expressions of panicle branch development-related genes in young panicle

3 讨论与结论

近些年来，以常规途径直接增加穗粒数和穗密度来实现增产难度越来越大。通过聚合簇生性状或调控穗特异表达基因来增加穗粒数和穗密度不失为一个可以尝试的手段。育种家也一直在摸索利用簇生稻资源来创造水稻新品种。李经勇等[21]将稗草总DNA通过花粉管通道法导入水稻恢复系渝恢1351并从中选取优质后代再结合传统杂交手段创制了一批具有簇生穗表型是优良恢复系。利用具有顶小穗3粒簇生的常规中籼稻突变体和常规早籼稻杂交、后代复交、并经世代选育，俞法明等[22]获得较对照增产的顶小穗2～5粒簇生的常规早籼稻新种质。但目前在簇生稻品种的选育上还没有明显的进展与突破。一方面与大部分簇生穗种质资源常常伴随结实率偏低有关，另一方面有关簇生穗形成的分子机理还尚未阐明，无法在生产中提供相应的指导。目前已发现的簇生穗突变体多数还伴随枝梗和颖壳发育异常、育性降低等其他表型。我们推测簇生穗调控基因很可能和其他穗发育相关基因直接或间接关联协同调控水稻的穗发育，目前已分别有具体的研究表明水稻中根、分蘖、籽粒形状、花粉育性等因某个细胞周期相关基因异常而直接影响导致对应的组织发育异常，而穗发育处于上述组织发育的中间阶段，因而推断枝梗发育极有可能也直接受到细胞周期的影响。目前水稻中还没有关于枝梗发育与细胞周期直接相关的研究。Fouad利用硅酸盐分析方法，对水稻9个不同稻属的CDKA编码基因及其对应蛋白进行了鉴定，发现其中的Brachyantha具有一个修饰的SUC/CKS （CDC2/cyclin依赖性激酶调节亚基抑制因子）结合基序，并提出观察到的这个变异可以通过传统育种或分子方法来操纵细胞分裂和栽培水稻品种的生长[23]。本研究探索通过对穗发育尤其是枝梗发育相关基因及细胞周期相关基因的表达量进

行分析，内江P164中CDKs的表达量显著下调而B类cyclin的表达量显著上调，CDKs能在所有真核细胞中调控细胞周期的整个过程，其活性既受到和它结合的cyclin的调节，又与特异的磷酸化和去磷酸化有关，因而推测内江P164的簇生穗表型很有可能也与磷酸化相关。后续可以进一步通过磷酸化途径入手，深入对这些差异基因深入研究，验证其在簇生穗形成中的具体功能，将有助于进一步阐明簇生穗的形成分子机理，为簇生稻遗传育种提供参考。