基于蛋白质相互作用网络的茶树抗假眼小绿叶蝉研究

王 芬，裴会敏，文 狄，陈 志，李 静

（黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州 都匀 558000）

0 引言

【研究意义】假眼小绿叶蝉（Empoasca vitis Gothe）属叶蝉科，是小绿叶蝉的优势种群，也是茶叶的主要害虫之一[1,2]，其成虫和若虫刺吸为害茶树新梢、嫩叶，严重影响茶叶的产量和品质[3,4]。该虫1年可发生9～13代，虫态混杂，世代重叠。通常在5～6月份、9～10月份形成2个虫口高峰[5,6]，广泛分布于浙江、福建、贵州、海南、云南、安徽等茶区，一般可致夏、秋茶损失20%左右[7]，目前主要以物理、化学和生物方法进行防治。通过构建被假眼小绿叶蝉侵染和未侵染的茶树差异基因蛋白质相互作用网络（PPIN）[8−10]，探寻差异基因参与的信号通路发生改变的分子机制，为培育良种茶苗提供理论依据。【前人研究进展】蛋白质是茶叶的重要组成成分，占茶鲜叶干物质的20%～30%[11−13]。茶树在抵抗害虫胁迫时往往会表现出抗虫性状，合成大量的胁迫诱导蛋白[14]。如何增强茶树生长适应性，提高抗寒、抗旱、抗病等能力，已日益成为茶树栽培生产和品种选育中亟待解决的问题。杜鹃[15]研究了平阳特早茶树在Pb胁迫下，接种根内球囊菌和未接种的茶树叶片中蛋白组差异，对茶树Pb胁迫的进一步探究提供了重要的线索。朱俊庆等[16,17]通过不同茶树品种对假眼小绿叶蝉抗性的研究发现，嫩叶栅状组织和嫩茎皮层越厚，抗虫性越强。还有研究者从茶小绿叶蝉侵染乌龙茶和铁观音前后茶树的挥发物组成和含量都发生较大的变化的角度，来研究茶树的抗虫性[18]。此外，有研究通过外源MeSA诱导，发现茶树应对假眼小绿叶蝉的取食行为通过产生防御蛋白来抵抗外界的侵害[19]。另外，有研究人员通过分析假眼小绿叶蝉取食嫩叶后的CsRIP1和CsRIP2表达情况，来研究茶树防卫反应[20]在植物与害虫相互作用机理方面，大多数植物在受到害虫侵害时，将通过改变体内蛋白质的表达来完成信号的感应和传递，从而引起植物相应的反应，研究相关蛋白质有利于更好地了解生物体应对害虫侵害时的分子机制。【本研究切入点】假眼小绿叶蝉对茶树的危害的应对方式目前研究得还不够深入，因此，亟须构建茶树的蛋白质相互作用网络来探究侵害的分子机理。【拟解决的关键问题】本研究通过对有无受假眼小绿叶蝉侵害的都匀毛尖茶树鸟王种进行转录组测序，基于同源比对算法构建0 h与12 h、0 h与24 h的差异基因蛋白质相互作用网络，在蛋白质相互作用网络的基础上研究茶树抵御假眼小绿叶蝉侵害，为都匀毛尖病虫害防治、保证都匀毛尖产品质量和产量，对地方社会经济的可持续发展具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

茶叶选用黔南民族师范学院大棚培养的都匀毛尖茶树鸟王种扦插苗，假眼小绿叶蝉取自黔南州都匀市螺丝壳茶园。

1.2 假眼小绿叶蝉侵染茶苗

选取9盆长势一致的茶苗分别放在3个封闭良好的纱网笼子中，分别标记为0 h、12 h和24 h。8月份将从茶园捉来的4龄假眼小绿叶蝉在第2个笼子和第3个笼子各放50只，第1个笼子不放。假眼小绿叶蝉取食0 h、12 h和24 h后，分别在3个笼子中进行采样，每个时间点设置3个生物学重复。取样时要选择长势一致相同叶位的嫩叶，置于－80℃冰箱保存，之后送往北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序。

1.3 差异基因蛋白质相互作用网络构建

将二代得到的转录本与安徽农业大学宛晓春团队的中国种茶树基因组[21]进行序列比对，并分析0 h与12 h，0 h与24 h的差异基因，运用同源比对的方法将差异基因与STRING数据库[22]进行比对，利用Cytoscape 3.3.0[23]将比对上的差异基因进行蛋白质相互作用网络的构建，最后通过GO和KEGG对蛋白质相互作用网络进行注释。

2.1 网络构建

分别取假眼小绿叶蝉侵染0 h、12 h和24 h的鸟王种嫩叶进行转录组测序，根据不同样品的基因表达量筛选0 h与12 h、0 h与24 h的差异表达基因，并利用同源比对和SRTING数据库构建差异基因蛋白质相互作用网络（表1、图1），图中红色的菱形和紫色的V形代表相互作用数目最多的蛋白，可能是网络中的关键节点，如果将关键节点去除，整个网络就会瘫痪，因此，关键节点在网络中具有重要的 作用。

表 1 差异基因相互作用数目Table 1 Number of PPIs in DEGs

图 1 侵染0 h和侵染24 h差异基因蛋白质相互作用网络Fig. 1 PPINs of DEGs between 0 h and 24 h after infestation

2.2 差异蛋白功能预测

通过差异基因的蛋白质相互作用网络可以预测关键蛋白和蛋白质的功能，如果已知一个蛋白质的功能，那么与这个蛋白相连接的其他蛋白可能具有类似的功能。在假眼小绿叶蝉侵染0 h与12 h的差异基因蛋白相互作用网络中共212个互作，其中

TEA027317、TEA020609、TEA009850、TEA015801、TEA007831、TEA002561、TEA007510和TEA010299是连接度最大的8个蛋白，即可能为关键蛋白。通过GO和KEGG注释，发现TEA027317是rac样GTP结合蛋白ARAC7，具有GTP酶活性，参与脱落酸激活信号通路和GTP酶介导的信号传导。与其互作的蛋白有19个，由此可以推出这19个蛋白也可能具有类似的功能。TEA002561、TEA010299、TEA000210、TEA010470的互作主要参与DNA复制、碱基切除修复、核酸切除修复、错配修复。TEA000833、TEA030826、TEA027049的相互作用涉及植物激素信号转导。TEA012289与亚油酸和亚麻酸代谢相关。因此，在假眼小绿叶蝉侵染茶叶的过程中，茶树通过各种蛋白互作启动相应通路来应对假眼小绿叶蝉的侵害。

在假眼小绿叶蝉侵染都匀毛尖叶片0 h和24 h的差异基因蛋白质相互作用网络中共有3 551个互作，TEA019056、TEA009394、TEA027713、TEA003559、TEA021407、TEA022367、TEA027317、TEA009850、TEA020609和TEA015585是度最大的10个蛋白，也是网络中最重要的蛋白。TEA019056是周期蛋白依赖性激酶，具有ATP结合活性，与之相连的蛋白有139个，也可能具有类似的功能。对相互作用的蛋白进行GO和KEGG分析，TEA002561、TEA010299、TEA026104、TEA018073、TEA029227、TEA006566、TEA031297、TEA005054、Camellia_sinensis_newGene_2675、TEA031525、TEA019489、TEA020024、TEA021543、TEA010470、TEA016435、Camellia_sinensis_newGene_1068、TEA028102、Camellia_sinensis_newGene_28382的蛋白质相互作用主要参与DNA复制，嘌呤代谢，嘧啶代谢、碱基切除修复，核酸切除修复、错配修复和同源重组。TEA025148、TEA000500、TEA021043、Camellia_sinensis_new Gene_249、TEA008785的互作与植物病原体互作有关。TEA014197、TEA025845、TEA000833、TEA004537的相互作用主要参与植物激素信号转导。TEA012289参与的互作主要进行亚油酸代谢和亚麻酸代谢。以上结果说明，取食24 h比12 h需启动更多的蛋白质相互作用来应对假眼小绿叶蝉的侵害，并且需大量的代谢通路来应对外界的侵害。

2.3 差异基因蛋白质相互作用网络的拓扑属性

将0 h与12 h、0 h与24 h的差异基因蛋白质相互作用网络进行综合得到合并的差异基因蛋白质相互作用网络，该网络共531个节点，3 605个互作。对3个网络进行比较分析，均表现出网络的小世界特性。网络的聚合系数、特征路径长度、最短路径和半径表明，它们的全局属性没有显著的差异（表2）。

将0 h与12 h、0 h与24 h的差异基因蛋白质相互作用网络进行比较分析，发现0～12 h与0～24 h共同的互作有158个，节点80个，不同的互作有3 447个，节点有525个（图2），说明都匀毛尖茶苗在侵染12 h后继续启动更多的蛋白互作来应对假眼小绿叶蝉的侵染。

0≤中介中心性的值≤1，Cb(i) = ∑m≠i≠n[σmn(i)/σmn]，m、n和i都是网络中节点，即蛋白，σmn表示蛋白m和蛋白n之间的最短路径数，σmn(i)代表蛋白m到蛋白n之间经过蛋白i的最短路径数（图3-a）。接近中心性的值的范围也在0～1，Cc(i) = 1/avg［S(u,v)］，S(u,v)表示u和v之间的最短路径，avg［S(u,v)］表示平均最短路径（图3-b）。蛋白i的拓扑系数是Ti=avg [S(i,j)]/ni。S(i,j)表示i和j共同的相邻蛋白数，ni表示i的邻居数。度是指蛋白的相互作用数目，相互作用数目越多，说明蛋白的度越高，进一步说明这个蛋白越重要。在假眼小绿叶蝉侵染0 h和12 h、0 h和24 h的差异基因蛋白质相互作用网络中，我们发现蛋白的度服从幂律分布（图3-d），其中0 h与12 h的差异基因蛋白互作网络中，P(x)≈40.192x−1.248，R2=0.811，相关性是0.985。0 h与24 h的网络中，P(x)≈85.166x−0.956，R2=0.681，相关性是0.97。说明大部分蛋白的度比较低，少部分的蛋白的度比较高，是一种无尺度现象，说明预测到的差异基因蛋白质相互作用网络可靠性高。

表 2 三个网络的全局特性Table 2 Global properties of 3 networks

图 2 0 h与12 h的差异基因互作与0 h与24 h的差异基因互作的重叠数与差异数Fig. 2 Number of overlapping and different PPIs between 0-12 h and 0-24 h DEGs

图 3 假眼小绿叶蝉侵染0 h和24 h的差异基因蛋白互作网络拓扑属性Fig. 3 Topological properties of PPINs in 0 h and 24 h DEGs

3 讨论与结论

利用同源比对的方法和String数据库预测出0 h与12 h、0 h与24 h的差异基因的蛋白质相互作用网络及合并的网络，并运用Cytoscape 3.3.0将它们可视化，并对3个网络进行拓扑属性分析，发现蛋白的度服从幂律分布，说明只有少部分蛋白的相互作用较多，是一种无尺度现象，并且3个网络都表现出小世界特性。但是，0 h与12 h的差异基因蛋白质相互作用网络跟0 h与24 h网络的匹配度低，只有158个重复，造成这种结果的原因可能是预测出的0 h与12 h的差异基因的蛋白质相互作用较少所致。

通过蛋白质相互作用网络可以预测关键蛋白及蛋白质的功能，在合并网络中，连接度最大的前10个蛋白与0 h与24 h的差异基因蛋白网络中的关键蛋白一致，其中TEA027317、TEA020609、TEA009850的度分别为73、69、67，既在假眼小绿叶蝉侵染0 h和12 h的差异基因互作网络中，也在0 h和24 h的网络中，说明在侵染12 h的过程中这三个差异基因启动相应的互作来抵抗假眼小绿叶蝉的侵害，而在侵染24 h时，除以上三个差异基因的互作，继续启动更多的互作来进行防御，与杨会敏[24]研究的假眼小绿叶蝉取食后茶树叶片内各种酶活性升高启动更多的酶促反应对害虫进行防御相一致。本研究在蛋白质相互作用网络的基础上研究茶树抵御假眼小绿叶蝉侵害，为更深入全面了解其抗病机理提供理论依据。

通过对差异蛋白质相互作用网络中的蛋白进行功能预测，发现在假眼小绿叶蝉取食茶叶过程中，主要通过植物病原体互作，植物激素信号转导，亚麻酸和亚油酸代谢等代谢通路来抵抗假眼小绿叶蝉的侵染，与前人的研究结果一致[25,26]。同时，茶叶在漫长的进化过程中，演化出通过产生各种次级代谢产物抵御虫害的自我防卫机制[27]。通过对鸟王种的蛋白质相互作用网络研究为评价茶叶及其制品的品质及药用价值，以及用于解读茶树抵御假眼小绿叶蝉侵染的代谢机理提供参考。对于选育良种并最终实现茶叶增产意义重大，为进一步开发和利用都匀毛尖茶资源，促进黔南州经济社会发展提供理论依据。