产KPC酶肺炎克雷伯菌对多粘菌素异质性耐药及治疗策略的研究

程可平，艾 涛，焦 政

（江西省进贤县人民医院，江西 进贤 331700）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kpn）在临床上存在于多个系统疾病中，例如肺炎、气管炎、泌尿疾病等[1]。产KPC酶肺炎克雷伯菌是Kpn的一个主要耐药菌类型。耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）在全球众多国家均有发现，并具有广泛流行性，是肠道感染的主要病原菌，严重威胁人类生命健康[2]。近年来，由于Kpn对几乎所有β-内酰胺类药物及多种非β-内酰胺药物的耐药性不断增加，临床抗菌药物的选择非常受限制[3]。因而碳青霉烯类抗生素特别是广谱抗生素的使用不断增加，但是越来越多研究发现CRKP对其耐药性越来越强，尤其是多重耐药菌株的检出率不断提高，导致临床疗效不理想[4-5]。多粘菌素由于其可能会对肾脏和神经造成损伤，过去临床应用较少，但是现在对多重耐药菌并无有效抗菌药物，因此多粘菌素被重新应用，且成为治疗多重耐药革兰阴性菌最直接、有效的抑菌方案[6-7]。大量研究发现在多粘菌素发挥抑菌作用的过程中，有新的耐CRKP菌株出现。因此本文通过本院收治72 株CRKP菌探讨对多粘菌素异质性耐药及治疗策略。

1 材料与方法

1.1 一般材料 收集本院2017年1月—2018年12月微生物实验分离出CRKP菌72 株，所有菌株的来源均为本院临床病人，菌株保存在甘油肉汤中，采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析系统分析，检测结果按照CLSI标准执行。质控菌株为Kpn ATCCBAA-1705、ATCCBAA-1706，购自卫生部门。

1.2 仪器及试剂 全自动细菌鉴定系统（梅里埃VITEK 2 Compact），PCR仪（PD公司，美国）；－80 ℃低温冰箱（海尔生物医疗）；琼脂糖（Biskanten，青岛）；QW988-WGZ-2XJP比浊仪（北京海福达有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌悬液配置及鉴定：将临床分离株均匀接种于血琼脂平板上，随机挑取5 个菌落，采用无菌生理盐水配置菌悬液，比浊仪测定菌悬液浓度并调整至0.5麦氏浊度（约为1.5 ×108/mL），按说明书操作步骤采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统鉴定菌株。

1.3.2 药敏实验：运用药敏复合板进行常规药物敏感实验，抗菌药物分别为美罗培南、哌拉西林、头孢噻肟、头孢吡肟、庆大霉素、莫西沙星、克拉维酸、环丙沙星、氧氟沙星、替加环素、多粘菌素B、氨曲南。

1.3.3 改良Hodge试验：将0.5麦氏浊度Kpn用无菌生理盐水按1:10的比例稀释，均匀涂抹到MH琼脂平板上，静置10 min，将美罗培南纸片贴在纸板中央，挑取3～5 个菌落垂直于纸片，在平板与纸片中间画线，37 ℃孵育18～24 h，若划线处有菌群生长，表示该菌株产KPC酶。阳性对照为Kpn ATCCBAA-1705，阴性对照为Kpn ATCCBAA-1706。

1.3.4 耐药基因检测：煮沸法提取菌群DNA，采用聚合酶链式反应（PCR）检测耐药基因blamcr-1、blaKPC、blaCTX-M和blaNDM-1，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性产物通过上海铂尚公司检测，PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.5 微量棋盘稀释法测定最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration, MIC）和分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration, FIC）：采用MH肉汤培养基将菌悬液按1:8比例稀释，分别倍比稀释多粘菌素B、美罗培南和利福平至7个浓度梯度，浓度范围为多粘菌素B 0.5～256 μg/mL，美罗培南5～2 560 μg/mL，利福平2.5～1 280 μg/mL。在96孔板上按棋盘分布分别将多粘菌素B与美罗培南、利福平组合，每孔添加50 μL稀释药液再加入100 μL稀释菌液，37 ℃孵育20 h，肉眼观察MIC，并计算FIC，FIC≤0.5为协同作用，0.5＜FIC≤1为相加作用，2＜FIC≤2为无关作用，FIC＞2为拮抗作用。FIC＝MIC甲药联用/MIC甲药单用＋MIC乙药联用/MIC乙药单用。

1.4 统计学分析 采用WHONET 5.4统计学软件进行菌群药物敏感、耐药等数据分析。计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，α＝0.05为检验水准。

2 结果

2.1 菌株来源及分布 72 株CRKP菌来源分别为神经内科15 株，ICU 14 株，神经外科10 株，泌尿外科9株，呼吸内科8 株，急诊内科6 株，急诊ICU 4 株，普外科3 株，血液内科2 株，肝病科1 株。送检样本包括痰42 株，尿液18 株，腹水4 株，全血3 株，脑脊液3 株，切口分泌物3 株。

2.2 CRKP对抗菌药物敏感度 在72 株CRKP菌中，耐药程度依次是：替加环素（80.20%）、环丙沙星（73.50%），克拉维酸（45.80%）、头孢噻肟（39.30%）；多粘菌素B敏感度最高为100%，其次是美罗培南96.10%，见表2。

表2 CRKP对抗菌药物敏感度（%）

2.3 改良Hodge实验结果 在所有CRKP菌株中，发现在划线处出现不同程度的生长，通过改良Hodge试验中发现65 株阳性表达为产碳青霉烯酶Kpn，阳性率为90.28%，见图1。

图1 改良Hodge试验结果

2.4 耐药基因检测 PCR产物凝胶电泳结果显示，KPC-2菌株阳性数量为66 株，但未见mcr、CTX-M及NDM-1阳性菌表达，见图2。

图2 KPC-2凝胶电泳结果

2.5 药物联用对CRKP的FIC分布及协同作用率比较 多粘菌素B与美罗培南组合的协同抑菌率为58.33%，相加抑菌率为41.65%，多粘菌素B与利福平组合的协同抑菌率为70.83%，相加抑菌率为29.17%，二者的无关和拮抗作用均为0%，两组药物的协同作用率差异无统计学意义（χ2＝2.459，P＝0.117），见表3。

表3 药物联用对CRKP的FIC分布及协同作用率比较[例(%)]

3 讨论

Kpn引起的感染在临床上比较常见，大量临床病例发现，此类患者通常需要进行有创性操作治疗，包含深静脉置管及气管插管等，导致机体菌群紊乱，大大增加感染风险，引起感染性疾病。Kpn感染易发于老人、幼儿及免疫力低下者，研究[8-9]表明ICU患者更容易感染Kpn。耐碳青霉烯类药物在治疗Kpn时广泛应用，导致其耐药性逐渐提高，因此CRKP的检出形势不容乐观[10]。因此以多粘菌素为基础的针对CRKP耐药性用药方案在临床应用中具有重要作用。

本文研究发现CRKP的来源多数在ICU、神经内外科，在患者的痰及尿液中较多，神经外科一般是对脑部进行手术，术后需要在ICU病房进行观察，患者病情严重且免疫能力低下，易出现反复感染，需要长时间进行抗菌治疗，致使ICU成为多重耐药菌容易爆发流行地点[11-12]。在72 株CRKP中，对替加环素的耐药性超过80%，对环丙沙星的耐药性达到70%以上，说明KPC酶能够引起Kpn对各种临床常用抗菌药物产生耐药性，而对多粘菌素B的敏感性为100%，表明CRKP对多粘菌素B非常敏感，临床治疗效果较为理想。

在72 株CRKP中，共有65 株CRKP为产KPC阳性，占90.28%，PCR检测耐药基因发现有66株CRKP的KPC-2基因表达为阳性，阳性率为91.67%，KPC-2基因检测的准确度高于改良Hodge试验。KPC的基因可选择性进行转移，并依靠多种基因进行多重传播，从而进行耐药和移动，后者也是引发Kpn耐药并进行多重感染的重要机制[13-14]。CRKP包含许多耐药机制，在细菌细胞壁上出现大量青霉素结合蛋白改变，并发现产碳青霉烯水解酶占据主导因素，其中KPC-2基因是造成医院感染Kpn耐药的主要基因，KPC-2在Kpn中的作用不可忽视[15]。

本文为了探讨多粘菌素B对CRKP的抑菌程度，采用联合药物作用发现与美罗培南联合后，协同作用为58.33%，相加作用为41.67%，与利福平联合后发现协同作用70.83%，相加作用为29.17%，两种联合方法均对CRKP有良好的抑制作用。周翔等[16]的研究中采用多粘菌素B联合用药对Kpn进行抗菌效果分析，协同作用率为85.71%。张爱荣[17]将亚胺培南与多粘菌素B联合对Kpn主要具有协同作用。本文研究结果与上述文献结果相似，可能与药物抗药效果及菌株特异性有关。卞婷婷等[18-19]研究证实通过多粘菌素B和磺胺类及其他类联合用药对KPC菌株出现协同作用，这与施腾飞等[20]研究结果一致。

综上所述，早期预防和治疗是应对CRKP的有力措施，需运用科学方式进行抗菌药物治疗。采用多粘菌素B联合其他抗菌药物，对CRKP的抑菌效果较好，为临床抗感染治疗带来新的选择。