柱前衍生高效液相色谱法测定盐酸苯海索中甲醛

2021-05-30＊

当代化工研究 2021年9期

关键词：二硝基苯量瓶无水乙醇

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（江苏天士力帝益药业有限公司江苏 223003）

前言

盐酸苯海索通过阻断纹状体的胆碱能神经通路，恢复帕金森病患者脑内多巴胺和乙酰胆碱的平衡，从而改善患者的帕金森病症状，是中枢抗胆碱抗帕金森病药。

盐酸苯海索的合成以哌啶盐酸盐，多聚甲醛，苯乙酮，氯代环己烷为起始物料，经多步反应得到盐酸苯海索[1]。

起始物料多聚甲醛在酸性条件下解聚产生甲醛。甲醛具有强烈的致癌和致畸性，是一种基因毒杂质，毒性效应终点多样、危害阈值低，因此对其控制至关重要。目前药品中微量甲醛的测定方法有分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法和气相色谱法等方法。分光光度法诱导期长，抗干扰能力差；荧光光度法由于很多物质自身不能发射荧光；色谱法灵敏度高、准确度高、自动化程度高，HPLC-MS及GC仪器设备昂贵。采用HPLC色谱法测定甲醛时，甲醛极性较大，出峰早，在紫外检测器中吸收非常弱，所以通过衍生化反应引入强紫外吸收的基团，通过测定衍生物含量间接测定甲醛残留量。在酸催化的作用下，2,4-二硝基苯肼与甲醛反应生成2,4-二硝基苯腙，经过流动相的洗脱，在柱子上会有保留，所以本文采用2,4-二硝基苯肼对甲醛衍生化，通过测定2,4-二硝基苯腙测定盐酸苯海索中甲醛含量。衍生化反应如图1。

图1

根据盐酸苯海索每日摄入最大剂量20mg，用非常保守的方法TTC值（1.5μg/天）计算，甲醛可接受的浓度限度75ppm（1.5μg·d-1/20mg·d-1）。

1.仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪；氨水（AR）；磷酸（HPLC，ACS），无水乙醇（AR），2,4-二硝基苯肼（AR），乙腈（HPLC，Scharlau），甲醛溶液（AR）；盐酸苯海索（批号：01，02，03）。

2.方法与结果

(1)方法

①色谱条件

色谱柱为C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；以磷酸溶液（取磷酸5.75g，加水稀释至1000ml，用氨水调pH值至2.85）-乙腈（50:50）为流动相；检测波长为336nm，柱温为30℃，进样量为20μl，流速为1.0ml/min。

②溶液配制

空白溶液：精密量取无水乙醇5ml、磷酸溶液（1→50）3ml、2,4-二硝基苯肼无水乙醇溶液（0.05→100）1ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，放置7小时，作为空白溶液。

取甲醛溶液（使用前按照中国药典2015年版二部甲醛溶液[含量测定]项下规定测定含量）适量，精密称定，用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含15μg的溶液，摇匀，得对照品贮备液I；精密量取1ml，用无水乙醇稀释制成1.5μg/ml的溶液，摇匀，即得对照品贮备液II。

精密量取对照品贮备液II 5ml，置10ml量瓶中，精密加入磷酸溶液（1→50）3ml、2,4-二硝基苯肼无水乙醇溶液（0.05→100）1ml，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，放置7小时，作为对照品溶液。

取本品约0.5g，精密称定，置25ml量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法操作，作为供试品溶液。

③测定法

记录空白溶液和对照品溶液色谱图。按外标法以峰面积计算2,4-二硝基苯腙，不得超过75ppm。

(2)方法学验证

①专属性

取本品约0.5g，精密称定，置25ml量瓶中，精密加入对照品贮备液I 2.5ml，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法操作，作为供试品加标溶液。

分别精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液及供试品加标溶液进样，记录色谱图。结果表明，空白溶液、供试品溶液对2,4-二硝基苯腙峰无干扰，2,4-二硝基苯腙峰与相邻峰分离度良好，本方法专属性良好。

图2

②线性

精密量取0.2ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml对照品贮备液I，分别置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法配制，作为线性1～8溶液，分别进样，记录色谱图。以线性浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程为A=459.57C+6639.6（R2=0.9997），结果表明，甲醛在2.977～1488.7ng/ml范围内线性关系良好。

③定量限及检测限

取对照品溶液，加无水乙醇逐步稀释成不同浓度，分别进样。在信噪比约为10:1时，测得甲醛的定量限浓度为2.977ng/ml；在信噪比约为3:1时，测得甲醛的检测限浓度为0.595ng/ml。

④重复性

分别配制6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图。按外标法计算6份供试品中甲醛含量，结果，6份供试品甲醛含量RSD为1.89%，本方法重复性良好。

⑤回收率试验

取本品约0.5g，精密称定，置25ml量瓶中（配制9份，分三组），分别精密加入对照品贮备液I 2.0ml、2.5ml、3ml，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，同法配制成80%、100%、120%加标溶液，分别进样，记录结果。甲醛加标回收率平均值为90.1%（RSD=1.56%，n=9），此方法准确度良好。