墨兰精油提取工艺优化及成分分析

邓乾坤，王 斌，史学伟，朱根发，杨凤玺，高 洁

（1.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000；2.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】兰花为兰科兰属植物，是中国十大名花之一，素有“国香”“君子之花”的美誉，在我国已有近2 000 年的栽培历史，并形成了极具中国特色的兰花文化［1］。因具有独特的文化和观赏价值，兰花历来是文人墨客喜爱的对象，在市场上具有良好的经济价值。孔子称国兰为“王者之香”，其香气为国兰的精髓和灵魂，是体现国兰观赏、文化及经济价值的重要性状，历来是人们用来评估和鉴定兰花品种优劣的重要条件之一。墨兰（Cymbidium sinense）又名报岁兰，适宜生长在半阴、温暖、湿润的环境中，主要分布于东南沿海地区的广东、广西、福建，以及西南地区的云贵川等地，品种丰富［2-3］，在广东国兰交易市场中最常见也最受欢迎。墨兰叶形优美，花香清新幽远，解郁提神，沁人心脾［4］，为优质香料物质，可在化妆品等领域进行良好应用。但有关兰花精油的应用及相关产品的开发相对较少，针对墨兰精油的开发和研究更为少见。因此，本研究开展墨兰精油提取工艺的研究并对提取的精油进行成分测定，以期为墨兰精油的开发应用提供技术及理论基础，进而提升墨兰的产业价值，促使墨兰产业链的延伸。【前人研究进展】研究表明，植物精油是一类从植物中提取的含芳香气味［5］的物质，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化以及保护心血管等作用［6］，可以作为天然抗氧化剂有效延缓食品变质、提升食用油和肉类的货架期。植物精油主要由萜类化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫类化合物等组成［7］，其中萜类化合物被认为是植物精油的主要成分［8］。李杰同时采用蒸馏法和萃取法提取了‘企黑’［9］和‘小香’［10］墨兰精油，并对精油组分进行了初步分析，发现墨兰精油主要含有棕榈酸、二十五烷、二十三烷、二十七烷、二十四烷醇等。近年来，越来越多方法被应用于提取植物精油，包括溶剂浸提法、水蒸气蒸馏法、超声波辅助萃取法、超临界CO2萃取法等［11-14］。其中，微波辅助萃取法所需设备简单，操作方便，萃取范围宽泛，出油率高，适合常规工业的工艺提取，因而广泛应用于天然植物有效成分的提取。【本研究切入点】墨兰香气清新优雅，但目前关于墨兰精油的产业应用几乎为空白。本研究采用新育成的‘迎春素’墨兰作为研究对象，采取超声辅助萃取法提取墨兰精油，通过单因素和正交试验优化墨兰精油提取工艺，并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）对墨兰精油的香气成分进行测定。【拟解决的关键问题】通过优化超声辅助萃取法提取墨兰精油的工艺，筛选墨兰精油提取的最适条件。结合墨兰精油成分的分析，为墨兰精油在食品、化妆品、医药以及农业环保领域中的应用提供科学依据，为墨兰资源产业的发展提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试墨兰品种为‘迎春素’，采于广东省农业科学院环境园艺研究所国兰种质资源圃内。将采摘后的‘迎春素’墨兰花朵用液氮冷冻，收集包装在不透气性聚乙烯袋中，带回实验室保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

试验有机溶剂有正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇等，均为国产分析纯；试验主要仪器包括RE212-B 旋转蒸发器（日本Yamato 公司）、BS 2000S 型电子天平（德国赛多利斯公司）、7980A-5975C 气相质谱联用仪（美国安捷伦公司）、SPME 进样器（瑞士CTC Analytics 公司）、MC202231DF-Ⅱ数显集热式磁力搅拌器（常州爱华仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 超声辅助萃取 将墨兰花朵在60 ℃下烘干处理 24 h，烘干后用粉碎机粉碎，过孔径380 μm的筛。称取 20 g 粉末样品，装入锥形瓶中，加入有机溶剂，待其混合均匀后，将墨兰料液置于超声波处理器中处理，设置超声波的频率、时间和温度进行超声波浸提［15］。超声作用后静置，将料液进行分离，再进行抽滤，将提取液与滤渣分离。对抽滤得到的提取液在旋转蒸发仪上进行浓缩（转速100 r/min，温度调至20 ℃，待温度稳定后再调至 60 ℃），将滤渣重复萃取 3 次，收集3 次萃取液，用旋转蒸发器分离有机溶剂，提取液中加入适量无水Na2SO4脱水干燥，称重，计算墨兰精油的提取率，平行试验3 次。

1.2.2 墨兰精油提取工艺优化 （1）单因素试验：以墨兰粉末为材料，选取不同的提取溶剂（95 %乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚）、料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）、提取时间（35、40、45、50、55 min）、提取温度（45、50、55、60、65 ℃）进行墨兰精油提取单因素试验，计算墨兰精油的得率。

（2）正交试验：以墨兰精油得率为指标，选取提取温度、提取时间、料液比作为影响因素，通过正交试验法 L9（33）确定有机溶剂提取墨兰精油的最佳工艺条件（表 1）。

表1 L9（33）正交试验因素表Table 1 L9（33）Orthogonal test factors

1.2.3 精油得率计算

式中，M1为瓶子和墨兰精油的质量（g），M2为瓶子质量（g），M 为墨兰质量（g），W 为墨兰精油的提取率（%）。

1.2.4 顶空固相微萃取 取5 mL 提取的墨兰精油于 20 mL 隔垫密封样品瓶中，加入转子置于磁力搅拌器上加热。将50/30 μm DVB/CAR/PDMS 型号萃取头在 GC/MS 进样口250 ℃下老化 5 min 后，插入顶空样品瓶进行悬空富集一定时间后取出萃取头，于 GC/MS 中解析、检测。

1.2.5 GC-MS 定性定量分析 墨兰精油的GC-MS 测定条件：选用HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速：1.0 mL/min；进样口温度 250 ℃，进样量 1 mL，分流比50∶1；程序升温条件：初始柱温度40 ℃，以2 ℃/min 升至90 ℃，再以4 ℃/min升至140 ℃，最后以7 ℃/min升至250 ℃。

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，溶剂延迟3 min，离子源温度230 ℃，四级杆温度150℃，扫描质量范围为 30～550 amu［16］。利用Wiley275.L 和NIST98.L 两个谱库对采集到质谱图中的香气成分串联检索，确定墨兰精油的香气成分。总离子流图用峰面积归一法计算各组分的相对百分含量，确定墨兰精油的组成成分。

试验数据使用SPSS 20.0 软件进行统计和方差分析。利用软件Origin 8.5 进行结果处理并作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 不同有机溶剂对墨兰精油得率的影响 称取 10 g 墨兰样品，选择石油醚、正己烷、95% 乙醇、乙酸乙酯 4 种有机溶剂为萃取剂，按料液比1∶9，在 45 ℃条件下提取 45 min，墨兰精油得率见表 2。

由表2 可知，4 种有机溶剂中，使用95%乙醇提取得到的墨兰精油产率最高、为1.92%。不同的有机溶剂对墨兰精油的得率、颜色和香味都会产生不同程度的影响。95%乙醇作为萃取剂，精油色泽比较理想，墨兰的特征香味浓郁，风味佳；石油醚作为萃取剂，精油得率虽然较高，但颜色呈墨绿色较混浊，而且香味淡薄，风味一般；正己烷作为萃取剂，精油得率不高，颜色为深墨绿色，香味淡薄，风味较好；乙酸乙酯作为萃取剂，精油得率较低，颜色为浑浊的墨绿色，香味淡薄，风味差。因此，95%乙醇是较好的有机溶剂提取剂，从价格、产率以及安全性等方面来考虑，选择 95%乙醇为提取剂较为适宜。而石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取得到的精油无论颜色还是香气都不太理想，不适宜作为墨兰精油的提取剂。

表2 不同有机溶剂对墨兰精油得率的影响Table 2 Effects of different organic solvents on the yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.2 不同料液比对墨兰精油得率的影响 称取20 g 墨兰样品，以95%乙醇作为萃取剂，选择不同料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）45 ℃萃取45 min，墨兰精油得率变化见图1。由图1 可知，在不同的液料比下萃取墨兰精油的精油得率不同。在料液比为1∶6～9 范围内，随着液料比的增加，墨兰精油得率呈现增加趋势，液料比为1∶9 时精油得率最高；料液比再增加时呈现下降趋势。在料液比较少的情况下，物料墨兰与有机溶剂接触的表面积比越大［17］，固液浓度差就会相应增加，溶解度和渗透压也会变大，加快了95%乙醇与墨兰油脂分子的扩散速率，有利于油脂从墨兰细胞组织中脱离出来，墨兰油脂分子扩散速率的增加［18］，同时提高了墨兰精油的得率。但当有机溶剂的量过高，液料比超过1∶9 时，不仅会增加试验成本，还会使墨兰精油得率降低。因此，从节约能源、降低成本、便于溶剂回收等综合因素考虑，最佳的液料比为1∶9。

图1 料液比对墨兰精油得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.3 不同提取时间对墨兰精油得率的影响 称取20 g 墨兰样品，以95%乙醇作为萃取剂，料液比为1∶8，45 ℃下分别提取35、40、45、50、55 min，墨兰精油得率变化见图2。由图2 可知，超声波提取时间由35 min 增加到40 min 时，墨兰精油得率大幅度增加；但是提取时间由40 min 延长到55 min 的过程中，墨兰精油得率反而呈现下降趋势。这是由于提取的初始阶段，物料中精油含量较高，固液间浓度差较大，溶解度和渗透压也变大，墨兰精油扩散速率较大，墨兰精油的油脂分子会不断扩散到95%乙醇的有机溶剂中，精油萃取率就不断增加；这可能是由于随着超声时间的延长，超声能转化成热能，同时溶质中的小分子相互碰撞导致精油溶液温度升高，使墨兰精油挥发严重，精油的得率反而下降，因此进一步延长超声作用时间对墨兰精油得率的提高无促进作用，有机溶剂中的油脂量趋于饱和，溶液体系渗透压趋于平衡［19］，得率不再增加，同时提取精油时间过长还会造成能耗的增加以及工序时间的延长，因此墨兰精油提取工艺最佳提取时间为40 min。

图2 超声提取时间比对墨兰精油得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.4 不同提取温度对墨兰精油得率的影响 称取20 g 墨兰样品，以95%乙醇作为萃取剂，料液比为1∶8，分别于45、50、55、60、65℃下萃取45min，墨兰精油得率变化见图3。由图3 可知，提取温度在45～50 ℃之间，随着温度的升高，墨兰精油得率呈现上升趋势，当温度增加到50 ℃时，墨兰精油得率为2.81%，显著高于其他提取温度下的精油得率；随着超声提取温度的进一步升高，墨兰精油得率呈现下降趋势。这是因为温度的升高增加了分子之间的扩散作用，促进溶剂分子渗透到物料细胞内部，增加了溶剂分子和油脂分子的活动动能，加剧溶剂分子的挥发和扩散，从而萃取率增加［20］。此外，温度升高以及随着提取时间的延长沸腾剧烈，导致95%乙醇的挥发加剧，减少了95%乙醇与墨兰的有效作用，不利于墨兰精油的萃取，因此当温度高于50 ℃时，墨兰精油得率出现下降现象。

图3 超声提取温度比对墨兰精油得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.2 正交试验结果与分析

选取料液比、超声提取时间、超声提取温度作为影响因素，以墨兰精油得率为指标，采用L9（33）正交试验进一步优化墨兰精油提取工艺。由表3 的R值可知，超声提取温度、超声提取时间、料液比3 个因素对墨兰精油得率的影响次序为：A 液料比＞B 超声提取时间＞C 超声提取温度，根据3 个k 值的最大值组合，确定最优工艺条件为A2B1C1，即料液比1∶9、超声提取时间35 min、超声提取温度45 ℃。在此条件下进行3次验证试验，墨兰精油平均得率为2.96%，精油香味较浓郁，风味佳。

表3 正交试验结果分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

2.3 墨兰精油香气成分分析

墨兰‘迎春素’的精油成分总离子流如图4所示。经GC-MS 分析，测得该精油的78 种组分（表4），含量占精油成分总量的94.36%，相对含量在1%以上的组分有20 种，分别为异戊醛、2-己烯醛、己酸乙酯、罗勒烯、1,2,3,4-四氢萘、壬醛、辛酸乙酯、紫罗兰酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、茶螺烷、L-芳樟醇、苯乙醛、乙二醇油酸酯、正十五烷酸、二氢紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、棕榈酸、十八碳二烯酸甲酯、二十四烷、二十五烷。这20种精油组分的相对含量达到了80.37%，其中，棕榈酸相对含量最高、为17.37%，其次为壬醛、正十五烷酸、二十四烷、合金欢醇，相对含量分别为10.57%、8.69、4.65%和4.03%。

图4 墨兰精油GC/MS 分析总离子流Fig.4 GC/MS analysis of total ion flow of essential oil from Cymbidium sinense

表4 墨兰精油成分及其相对含量Table 4 Compositions and relative contents of essential oils from Cymbidium sinense

（续表4）

将鉴定出的墨兰精油成分划分为醛类、醇类、芳香族类、酮类、烷烃类、烯烃类、羧酸类、酯类、其他类呋喃和酰胺共9 类化合物。从图5 可以看出，‘迎春素’精油中羟酸类、醛类、烷烃类、醇类最多，分别占化合物总数的26.21%、26.01%、11.59%和10.58%，这4 类化合物已达化合物总数的74.39%；酯类、酮类化合物相对少些，两者所占比重相近，分别为9.64%和9.25%；而芳香族类和烯烃类最少，占比3.77%和2.62%。

图5 墨兰精油不同化合物的相对含量Fig.5 Relative contents of different compounds in essential oil of Cymbidium sinense

3 讨论

3.1 超声辅助萃取对墨兰精油提取的影响

与采用水蒸馏法提取墨兰精油的方法相比［9-10］，本研究采用超声辅助萃取法的加热温度低，所需时间较短，可以防止墨兰精油中的热敏成分和易水解成分分解，最大限度地保留了精油中的特征香气成分。传统方法提取的精油得率仅为1%左右，而本研究采用超声辅助萃取法经优化后可获得较高的精油得率（2.9%左右），精油得率得到了大大提高。

不同溶剂会影响精油得率，选择有效的有机溶剂对精油提取有重要影响。王海波等［21］研究表明，利用不同有机溶剂提取的桂花精油，在形态、气味和颜色上有所区别，其中获得精油效果较好的为石油醚。而从价格、产率以及安全性等方面考虑，本研究选择乙醇作为提取剂较为适宜，所得到精油品质较好。

在影响超声波辅助提取精油的因素中，料液比通过影响固液浓度差、溶解度和渗透压等，改变有机溶剂与精油分子从植物细胞组织脱离的扩散速率；超声波提取时间和提取温度影响精油分子与有机溶剂的结合程度，从而影响精油得率。本研究认为料液比是影响精油得率的主要因素，与吴晓菊等［22］研究神香草精油工艺的结论相一致，而且从节约能源、降低成本、便于溶剂回收等方面综合考虑，通过优化料液比、提取时间和提取温度的工艺条件可获得较高的精油得率。

3.2 墨兰精油的香气成分分析

本研对墨兰‘迎春素’精油的香气成分进行测定，检测到78 种成分，香气成分较多且大部分以羟酸类、醛类、烷烃类、醇类为主。通过分析对比得出墨兰精油中的特征香气成分主要为棕榈酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金欢醇等，其中棕榈酸成分含量最高（17.37%），可以作为食品用的香料，也可添加到化妆品中滋润皮肤。而在文殊兰精油中检测到棕榈酸的相对含量为15.77%［23］，墨兰‘迎春素’精油的棕榈酸相对含量更多，而且这类芳香精油大多具有抑菌功能，推测墨兰‘迎春素’精油也可能具有抑菌活性。墨兰‘迎春素’精油的壬醛含量也较高，具有强烈的油脂气味和甜橙气息，其稀乙醇溶液有香草醛的香调，可用作食品添加剂，也可用于调制玫瑰、橙花、香紫罗兰、香味等香精。此外，墨兰中的合金欢醇物质具有青香韵的铃兰花香气，并有青香和木香香韵，这些特征香气可在今后应用于食品、化工和化妆品领域等。

4 结论

本研究以墨兰‘迎春素’为原料，采用超声波辅助萃取法提取墨兰精油，通过单因素试验和正交试验得到最佳的工艺参数如下：以95%乙醇作为萃取剂，料液比1∶9（g/mL），超声提取温度45 ℃，超声提取时间35 min，在此条件下墨兰精油得率为2.96%，精油墨绿色透亮，香味较浓郁，风味佳。料液比、超声提取时间、超声提取温度对墨兰精油得率的影响顺序为：液料比＞超声提取时间＞超声提取温度。通过顶空固相微萃取-GC-MS 联用技术分析鉴定了墨兰‘迎春素’精油的化学成分，共鉴定出78 种化合物，其中主要成分为棕榈酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金欢醇等物质。