人工智能气候室中灵芝富硒栽培研究

张玉华，张北壮，黄仕祥，何焕清，龚玉莲，曾碧健，蔡文韬，王 璐

（1.广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东 广州 510303；2.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；3.广东省农业科学院蔬菜研究所，广东 广州 510640）

【研究意义】硒是人体必需的重要微量元素［1］，能够提高机体免疫力［2-4］和抗氧化能力［5-8］，预防肿瘤等有关疾病发生［9-11］，在抗衰老及作为部分金属元素的天然解毒剂等方面有重要生理效果［12-13］。缺硒不仅使人的抵抗力下降，还会增加疾病的发生几率［14-15］。硒主要以无机态和有机态两种形式存在，不能由机体自主合成，只能从体外摄取，人体摄入的有机硒主要是硒蛋白和硒多糖［16］。对硒盐的毒理分析表明，无机硒（如硒酸盐、亚硒酸盐）的毒性相对较强，机体吸收率较低；而有机硒毒副作用较小，生物利用率高，生理药理功能也相对优越［17］。【前人研究进展】我国硒资源非常丰富，但均以无机态形式存在，使用范围和剂量受限。通过人工栽培灵芝将无机硒转化成有机硒是研究热点。有关研究表明，灵芝具有极强的富集硒功能，其耐硒能力和生物转化率比猴头菌、香菇、金针菇等食用菌高［18］，富硒灵芝是利用生物转化法研制的一种新的含硒补剂，对人体健康具有重要保健作用。【本研究切入点】目前利用灵芝为载体进行生物富硒的研究中，大多采用液体发酵进行［19-22］，也有少数学者以亚硒酸盐（亚硒酸钠）为硒源，采用固体基质栽培的方法进行［23］。开发生物源有机硒是为机体提供硒源的有效途径，也是目前人工栽培富硒灵芝研究的热点。【拟解决的关键问题】在人工智能气候室中，以硒矿粉作为硒源进行固体栽培灵芝富硒研究，充分利用硒矿资源，通过灵芝体内转化为有机硒，筛选固体基质栽培富硒灵芝的条件和较适合的硒浓度，为灵芝商业化栽培和富硒产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 硒源 供试硒源为硒矿粉，来源于湖北恩施，含硒量为50 μg/g。

1.1.2 培养基配方 供试灵芝（Ganoderma lucidum）菌株由广州中大圣之禾灵芝产业科技园筛选培育。母种培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4•7H2O 1.5 g、维生素B110～20 mg、琼脂18～20 g、水1 000 mL、自然pH。培养基经0.14～0.15 MPa灭菌30 min，冷却备用。

栽培种培养基配方为木屑73%、麸皮25%、蔗糖1%、石膏1%，将上述培养基质充分拌匀后加水，含水量达60%～65%，pH 6.0～6.5，搅拌均匀后装袋，在100℃灭菌室中灭菌16～18 h，保温3 h。培养基经灭菌后，冷却至25℃左右即可在超净工作台上按无菌操作规程接种。

1.2 试验方法

按广东省食品安全企业标准Q/GDSZH 002-2017 方法，采用分光光度计法测定各试验处理（表1）孢子粉和子实体的多糖和总三萜含量。按国家检测标准GB5009.93-2010 方法，采用原子荧光光谱法测定各试验处理孢子粉和子实体的硒含量。

表1 各处理菌包外源性硒矿粉与硒含量Table 1 The exogenous selenium ore powder and selenium content in bacteria packags of different treatments

1.2.1 栽培条件 试验在灵芝人工智能气候室栽培系统中进行［24］，栽培全程采用全热交换节能控制系统、恒温系统、新风系统、PM2.5 过滤系统、智能光照系统和超声波加湿技术等智能化的工业控制手段人工模拟自然生长环境，根据灵芝生长发育习性，在灵芝各生长发育过程给予所需的光质和光照强度、温湿度、O2、CO2等条件。进入人工气候室用于栽培的水经过磁化处理，进入培养室的空气采用PM2.5 过滤系统过滤，为灵芝生长发育提供最适宜的环境条件，确保结果可靠性。

1.2.2 栽培方法 （1）菌丝培育。将已接种的菌包置于25～28℃人工智能气候室中暗培养30～40 d。当菌丝体长满菌包时，再将菌包移入人工智能气候室进行出芝培养。

（2）出芝培养。培养室温度25～28℃，湿度60%～70%；CO2控制在400～600 μl/L；光照为1 000～1 200 lx。菌包出现子实体原基时湿度提高到85%～90%，且采用促进灵芝子实体原基分化的红光光照系统处理［25］，给予光谱波长为600～650 nm 的红光照射7 d，以促进灵芝子实体形成和孢子产生。子实体直径达到3 cm 时，湿度提高到90%～95%。子实体生长至成熟过程的颜色变化为白→浅黄→黄→红褐色，当子实体的边缘白色消失（边缘变红）时，表明子实体已成熟，开始喷射孢子，湿度逐渐降至65%～70%。

（3）采收。灵芝孢子喷粉历时28～30 d，完成喷粉后立即采收，并把收集到的孢子粉用低温洗涤、真空干燥净化专利技术［26］进行处理，使灵芝孢子粉的试验净度达到100%。灵芝子实体采收后，用清水洗净切片后在真空干燥室中进行干燥处理。灵芝孢子粉和子实体供试样本的含水量控制在10%以下。

2 结果与分析

2.1 灵芝孢子粉中硒含量

表2 试验结果显示，对照孢子粉的平均单产为9.57 g/菌包，硒含量为0.13 μg/g。处理2 孢子粉的平均单产为9.82 g/菌包，硒含量为1.10 μg/g，与对照相比，硒富集系数为8.5。处理3 孢子粉的平均单产为9.85 g/菌包，硒含量为3.20 μg/g，硒富集系数为24.6。处理4 孢子粉的平均单产为10.56 g/菌包，硒含量为4.40 μg/g，硒富集系数为33.8。处理5 孢子粉的平均单产为9.83 g/菌包，硒含量为6.80 μg/g，硒富集系数为52.3。处理6 孢子粉的平均单产为9.75 g/菌包，硒含量为7.70 μg/g，硒富集系数为59.2。单因素方差分析显示，各处理间灵芝孢子粉硒含量均存在极显著差异。LSD 检验结果显示，对照灵芝孢子粉硒含量显著低于硒矿粉添加处理；处理2 灵芝孢子粉硒含量显著低于其他处理，在本试验硒浓度范围，灵芝孢子粉中的硒含量随菌包中硒矿粉添加量的增加而提高，两者呈正相关。

表2 外源性硒矿粉对灵芝孢子粉硒含量的影响比较Table 2 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum spore powder

处理3、4 灵芝孢子粉产量显著高于对照，处理2、5 与对照和其他处理间不存在显著差异。可见，在本试验硒浓度范围，菌包中添加硒矿粉不影响孢子粉的形成和产量。

2.2 灵芝孢子粉中多糖和总三萜含量

表3 结果表明，对照中每100 g 孢子粉中多糖和总三萜含量与各硒矿粉添加处理差异不显著。可见，在本试验硒浓度范围，菌包中添加硒矿粉不影响孢子粉中多糖和总三萜的合成，不影响其含量。自然条件下，每100 g 灵芝孢子粉中多糖含量约1.8 g，总三萜含量约3.0 g，对照多糖及总三萜含量有大幅度提升，可见人工智能气候室为灵芝生长发育提供最适宜的环境条件，有利于灵芝孢子粉中多糖和总三萜的合成。

表3 外源性硒矿粉对灵芝孢子粉多糖和总三萜含量的影响比较Table 3 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum spore powder

2.3 灵芝子实体中硒含量

由表4 可知，对照子实体的平均单产为15.83 g/菌包，硒含量为0.35 μg/g。处理2 子实体的平均单产为14.65 g/菌包，硒含量为1.30 μg/g，与对照相比，硒富集系数为3.7。处理3 子实体的平均单产为15.12 g/菌包，硒含量为5.15 μg/g，与对照相比，硒富集系数为14.7。处理4 子实体的平均单产为15.05 g/菌包，硒含量为10.90 μg/g，与对照相比，硒富集系数为31.1。处理5 子实体的平均单产为14.86 g/菌包，硒含量为16.25 μg/g，与对照相比，硒富集系数为46.4。处理6 子实体的平均单产为15.20 g/菌包，硒含量为17.05 μg/g，与对照相比，硒富集系数为48.7。通过单因素方差分析，各处理灵芝子实体硒含量间存在极显著差异。LSD 检验结果显示，对照的灵芝子实体硒含量显著低于其他各处理，硒含量随菌包中硒矿粉添加量的增加而提高，两者呈正相关。

表4 外源性硒矿粉对灵芝子实体硒含量的影响比较Table 4 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum fruit body

单因素方差分析结果表明，对照灵芝子实体产量显著高于处理2，各硒矿粉添加处理间不存在显著差异。可见，菌包中添加硒矿粉不影响子实体的形成和产量。

2.4 灵芝子实体中多糖和总三萜含量

试验单因素方差分析结果（表5）表明，对照中每100 g 子实体中多糖和总三萜含量与其他5个处理差异不显著。可见，在本试验硒浓度范围，菌包中添加硒矿粉不影响子实体中多糖和总三萜的合成，不影响其含量。自然条件下，每100 g 灵芝子实体中多糖含量约0.6 g，总三萜含量约1.0 g，对照多糖及总三萜含量有大幅提升，可见人工智能气候室为灵芝生长发育提供最适宜的环境条件，有利于灵芝子实体中多糖和总三萜的合成。

表5 外源性硒矿粉对灵芝子实体多糖和总三萜含量的影响比较Table 5 Comparison of the effects of exogenous selenium ore ponder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum fruit body

3 讨论

硒对人体的重要生理功能越来越为各国重视，许多国家根据本国自身情况，制定硒营养的推荐摄入量。中国营养学会对我国不同人群的硒推荐用量有所不同，预防营养缺乏病人群的日摄入量为50 μg，亚健康保健人群的日摄入量为100 μg，预防癌症等重大慢性疾病人群的日摄入量为200 μg，治疗期间的日摄入量大于200 μg。我国是世界主要硒资源国家之一，已查明的硒蕴藏量占全球硒资源量的1/3，湖北恩施和陕西紫阳是我国两个高硒区，硒资源较丰富。然而，我国大多数地区属于“贫硒”地区，根据中国营养学会对我国13 个省市的调查，目前成年人日平均硒摄入量只有30 μg 左右，与推荐用量的最低限度50 μg相距甚远。灵芝是珍贵的药食两用真菌,具有较强的耐硒和富硒能力，富硒灵芝比普通灵芝表现出更好的生物效应，因此富硒灵芝作为利用生物转化法研制的一种新的含硒补剂对预防疾病和提高机体的健康水平具有极其重要的意义［16-17］。本试验以硒矿粉作为硒源添加到灵芝固体基质中，起到灵芝生物富硒的作用。本研究表明在灵芝菌包中添加硒5 000 μg，可获得含硒量为7.7 μg/g的灵芝孢子粉和含硒量为17.05 μg/g 的灵芝子实体，因此成年人在正常饮食条件下，每天食用3 g孢子粉可达到预防硒元素营养缺乏病和日常保健作用。灵芝子实体虽然含硒量较高，但由于木纤维结构不能直接被食用，要经过蒸煮的方法获得子实体煮出液，而目前对灵芝子实体煮出液含硒量的研究尚无报道。灵芝具有极强的富集硒功能和耐硒能力［18］，在硒浓度很高的基质中其生长发育不会受到抑制。本试验在固体栽培基质的菌包中加入硒源的最高含量为5 000 μg，远未达到抑制灵芝生长发育的浓度。下一步将提高硒浓度进行灵芝富硒试验，以期得到含硒量更高的灵芝子实体和孢子粉产品。

目前灵芝富硒研究大多采用液体发酵的方法［19-20］，液体培养的灵芝菌丝体硒含量较高，且与固体基质栽培子实体相比，发酵生产灵芝菌丝体简便、快捷、高效，因此采用发酵工程手段对灵芝进行富硒培养被认为是一种发展趋势，为规模化工业生产打下基础［21-22］。众多研究者为提高发酵培养获得的灵芝菌丝体的产量以及硒含量，在硒源选用、菌种选育及培养条件优化等方面做了很多研究［27］。灵芝中的三萜类成分主要分布在子实体的外周部分，含量随子实体成熟度的提高而递增［28］。大多数品种的灵芝在菌丝体生长发育期间仅形成三萜化合物的前体，而具有生物活性的三萜类化合物随子实体的生长发育才生成。子实体显蕾期三萜含量较低，成熟期含量最高［29］，菌丝体及发酵液中三萜类化合物的数量和种类均较少［30］。为获得富硒且富含三萜化合物的灵芝子实体和孢子粉，采用以硒矿粉作为硒源进行固体基质栽培灵芝是一种切实可行的方法。此方法既可充分利用硒矿资源，又可降低生产成本，对灵芝富硒栽培的推广与应用具有积极意义。

4 结论

本研究以硒矿粉为硒源加入到灵芝固体栽培基质中，探讨灵芝孢子粉和子实体富集硒的作用，以及对孢子粉和子实体产量、多糖和总三萜含量的影响。6 个试验处理中，每个灵芝菌包的加硒量分别为0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μg，产出孢子粉中硒的富集系数分别为1、8.5、24.6、33.8、52.3、59.2，产出子实体中硒的富集系数分别为1、3.7、14.7、31.1、46.4、48.7。试验结果表明灵芝孢子粉和子实体中硒的富集系数随菌包中硒的加入量增加而提高，两者呈正相关。在6 个试验处理中，灵芝孢子粉、子实体的产量以及多糖、总三萜的含量差异不显著。研究结果表明，在本试验的硒浓度范围内灵芝富硒栽培不影响孢子粉、子实体的形成和产量，孢子粉、子实体中多糖和总三萜的含量也不受影响。