蛇葡萄素抗乳腺癌的网络药理学分析及细胞试验研究*

2021-05-29张芸绮王妙然蔺晓菁李继斌

中国药业 2021年10期

李月，周永，张芸绮，王妙然，蔺晓菁，钟莹，李继斌

（1.重庆医科大学公共卫生与管理学院营养与食品卫生学教研室，重庆 400016； 2.重庆医科大学附属第一医院重大代谢性疾病转化医学重点实验室，重庆 400016； 3.重庆市巴南区人民医院临床营养科，重庆 401320）

乳腺癌为常见恶性肿瘤，2018年乳腺癌发生率位居全球恶性肿瘤第2，病死率第5［1］。目前，乳腺癌的临床治疗措施主要有手术切除、放射治疗（简称放疗）、化学治疗（简称化疗）和分子靶向治疗。随着早期诊断和治疗策略的改进，患者预后明显改善，但仍有较多患者最终出现肿瘤复发和耐受现象。蛇葡萄素（AMP）又名二氢杨梅素（DMY），属黄酮类化合物。植物化学研究表明，DMY和杨梅素分别是藤茶中的2种主要黄酮类化合物。AMP（20%～30%，m／m）的含量远高于杨梅素（1.5%～3.0%，m／m）［2］。AMP具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物学活性［3］。网络药理学以系统生物学为基础，对“药物-靶点-疾病”间关系进行分析，强调对信号通路的多调节途径，与中药“多成分-多靶点-多通路”的作用机制相似［4］。本研究中运用网络药理学方法预测AMP作用靶点及相关信号通路，并结合细胞试验对潜在作用靶点进行验证，阐释AMP抗乳腺癌的作用机制。现报道如下。

1 靶点研究

1.1 靶点获取

AMP靶点：通过Pubchem数据库获取AMP的3D分子结构，保存为sdf格式，然后上传至PharmMapper数据库，得到AMP作用的靶点基因，根据fit score进行排序，利用UniProt数据库的Retrieve／ID Mapping功能，将靶点的UniProt ID转换为Gene Symbol。

疾病靶点：以“breast cancer”作为关键词，检索GeneCards数据库，并进行筛选，获取疾病相关靶点数据集。使用R 4.0.4软件，提取AMP与疾病靶点中的共同靶点，作为AMP治疗乳腺癌的潜在作用靶点（即药物-疾病共同靶点）。

1.2 蛋白相互作用（PPI）网络的构建及关键靶点筛选

将上述过程获得的靶点交集导入String蛋白质分析平台，蛋白种类设置为“Homo sapiens”，构建PPI网络图，输出结果格式为TSV格式。将文件中的node1和node2信息导入Cytoscape 3.2.1软件中绘制PPI网络图，利用“Tools”中的“Network Analysis”功能进行网络拓扑结构分析，以大于或等于中位数1倍值的接近中心度和介数中心度，以及大于或等于中位数2倍值的度值为筛选标准。值越大表明节点在网络中的地位越重要，从而筛选出关键靶点。

1.3 关键靶点的生物过程与信号通路分析

将筛选出的关键靶点导入R 4.0.4软件中建模，对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探讨AMP关键靶点的功能分布，预测AMP潜在的调控通路。

将上述过程获得的靶点交集导入String蛋白质分析平台，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，构建PPI网络图，输出结果格式为TSV格式。将文件中的node1和node2信息导入Cytoscape 3.2.1中绘制PPI网络图，利用“Tools”中的“Network Analysis”功能进行网络拓扑结构分析，以大于或等于中位数1倍值的接近中心度和介数中心度及大于或等于中位数2倍值的度值为筛选标准；值越大表明节点在网络中的地位越重要。将PharmMapper数据库AMP作用靶点与GeneCards得到的乳腺癌相关基因进行比对，筛选出119个AMP-乳腺癌潜在作用靶点。结果见图1和图2。

图1 蛇葡萄素抗乳腺癌靶点分析Fig.1 The anti-breast cancer targets of ampelopsin

图2 蛇葡萄素抗乳腺癌PPI网络分析Fig.2 Protein-protein interaction（PPI）network of ampelopsin against breast cancer

1.4 关键靶点的生物过程与信号通路分析

将筛选出的关键靶点导入R 4.0.4软件中建模，对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探讨AMP关键靶点的功能分布，预测AMP潜在的调控通路。GO富集分析结果表明，这些靶点被富集到1 926个生物学过程，与response to oxidative stress，response to reactive oxygen species，cellular response to oxidative stress，regulation of MAPkinase activity，peptidyl-tyrosine phosphorylation 5个生物学过程密切相关；在细胞组分方面，靶点富集最多的是focal adhesion，cell-substrate adherens junction，cell-substrate junction；在分子功能中，主要起作用的是endopeptidase activity和protein serine／threonine kinase activity。结果见图3 A（图中BP为生物过程，CC为细胞组分，MF为分子功能）。

KEGG通路富集分析结果显示，与83个潜在靶点基因显著相关（P≤0.05）的通路有63条，排名靠前的信号通路为：PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signalingpathway、Rassignalingpathway等，涉及基质金属蛋白酶2（MMP2）和非受体酪氨酸激酶（SRC）等。结果见图3B。

2 细胞验证试验

2.1 仪器、试药与细胞

仪器：3111型CO2培养箱、1510型酶标仪（美国ThermoFisher公司）；AX10型倒置荧光显微镜（德国Zeiss公司）；CFX96型实时定量聚合酶链反应仪（美国Bio-Rad公司）。

试药：AMP（成都曼斯特生物科技有限公司，批号为A0049，含量≥98%）；CCK-8检测试剂盒（日本同仁公司）；Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；PRMI 1640培养基和胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco公司；Transwell小室（美国Coning公司）；PCR引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）。

细胞：三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231（受赠于重庆医科大学公共卫生与管理学院练雪梅教授）。

2.2 对MDA-MB-231细胞活力的影响

采用CCK-8法。于37℃及5%CO2条件下，培养MDA-MB-231细胞至对数生长期，调整细胞密度至每1 mL 1×104个，接种于96孔板中，每孔100μL。设定AMP浓度分别为0，20，40，60，80，100μmol／L，每组设5个复孔，作用24 h。培养结束后加入CCK-8，于450 nm波长处测定吸光度（A），计算细胞活力。细胞活力＝（A试验-A空白）／（A对照-A空白）×100%，A试验为具有细胞、CCK溶液和AMP溶液的吸光度，A空白为具有培养基和CCK溶液而无细胞的吸光度；A对照为具有细胞、CCK溶液而无AMP溶液的吸光度。结果，与0μmol／L比较，AMP浓度为20，40，60，80，100μmol／L时细胞活力显著减弱，40μmol／L作用最明显。结果见图4。采用GraphPad Prism 6.0统计学软件分析，行Dunnett-t和独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义（下同）。

2.3 对MDA-MB-231细胞迁移的影响

采用划痕试验及Transwell试验。将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%～90%后，利用200μL枪头进行垂直划痕。磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗3次，加入一定浓度的AMP处理细胞24 h，分别在0 h和24 h时镜下观察并采集图片。将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，加入20，40，60μmol／L的AMP处理细胞24 h后，将细胞接种于无基质胶小室。上室加入不含血清的培养基（200μL），下室加入含10%FBS的培养基（600μL）。24h后，细胞置4%多聚甲醛中固定15 min，PBS清洗细胞3次后，结晶紫染色液（0.05 mmol／L）染色20 min，在荧光显微镜下观察。结果见图5。

2.4 对MDA-MB-231细胞MMP2和SRC mRNA表达的影响

采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）法。收集细胞，细胞按2×105个／孔的密度接种于6孔板中，以Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，以β-actin引物为内参。PCR条件：95℃预变性10 min，95℃变性4 s，58℃退火10 s，65℃延伸5 s，共40个循环。以BioRad CFX软件记录扩增曲线和Ct值，根据2-ΔΔCt计算各基因的相对表达量，试验重复3次。引物序列见表1，结果见图6。

3 讨论

乳腺癌发病率和死亡率逐年上升，2018年全球癌症报告显示其占新发女性癌症的24.2%［1］。根据常规病理学分型，乳腺癌分为激素受体阳性、表皮生长因子受体2阳性和三阴性［5］3种类型。三阴性乳腺癌（TNBC）是指患者的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性，具有复发率高、病死率高和侵袭性强的临床特点［6］。本研究中采用的MDA-MB-231细胞即为TNBC细胞。目前，临床对乳腺癌的治疗多采取化疗，其存在很大的耐药性和复发性，预后极差。

有研究发现，显齿蛇葡萄富含的AMP具有良好的抗癌（尤其对骨瘤、胃癌和乳腺癌）作用［7-9］。有研究证实，AMP可通过抑制乳腺癌细胞Akt／mTOR通路，诱导细胞死亡［10］；通过MAPK和PI3K／Akt信号传导可促进高热诱导的淋巴癌细胞凋亡［11］；可有效抑制乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，且对模型小鼠的心、肝、肾功能均无明显影响［12］；也有研究探讨了AMP抑制肿瘤生长的可能机制，包括细胞周期阻滞、诱导细胞死亡和增加细胞内活性氧（ROS）的产生等信号通路［13］。

图3 蛇葡萄素抗乳腺癌靶点GO富集分析和KEGG通路富集分析Fig.3 Go enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the anti-breast cancer t argets of ampelopsin

图4 MDA-MB-231细胞生长情况Fig.4 The proliferation of MDA-MB-231 cells

本研究中利用网络药理学方法分析获得AMP作用于乳腺癌相关靶基因共119个。通过PPI网络筛选出10个关键靶点，包括MMP2，SRC，PTPN11，HRAS等。进一步对核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析，初步预测出AMP通过氧化应激反应等功能途径及PI3KAkt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路等多条通路途径发挥治疗乳腺癌的作用。此外，本研究中以MDA-MB-231细胞试验加以验证。结果表明，AMP作用MDA-MB-231细胞24 h能明显抑制细胞的活力及迁移，同时抑制与增殖迁移相关的MMP2和SRC mRNA的表达。但本研究结果显示，AMP对细胞迁移能力的抑制作用并非严格呈剂量依赖性，40μmol／L抑制能力强于60μmol／L，该现象与其他研究结果类似［14］，但具体机制还需进一步证实。

图5 MDA-MB-231细胞迁移能力Fig.5 The migration ability of MDA-MB-231 cells

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

在关键靶点中，采用细胞试验观察了AMP对SRC的作用。SRC与细胞增殖、分化、存活和侵袭相关［15］。已有研究发现，其通过PI3K，MAPK，STAT3，FAK信号通路介导癌细胞生长、迁移和血管生成［16-17］。黏着斑激酶（FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，FAK-SRC复合物在许多肿瘤细胞中被激活，FAK和SRC的催化活性在促进蛋白酶相关肿瘤转移方面扮演着重要角色［18］。大量研究显示，MMP尤其是MMP2和MMP9涉及肿瘤迁移环节［19］。有研究表明，AMP通过减少MMP2的表达来减弱增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的侵袭和迁移［20］；在肝癌细胞中，AMP也发挥了抑制肝癌细胞的迁移和侵袭作用［21］。在本研究中，AMP可显著降低MDA-MB-231细胞的MMP2表达水平，提示MMP2可能是AMP抑制肿瘤细胞迁移的关键靶点。