间质表型循环肿瘤细胞检测在肝癌临床应用价值

方法状 陆晓珑 方建明 陈献琦 刘艳省 张家敏

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为最常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐匿，侵袭、转移能力强，恶性程度高等特点[1]。早期常无特异症状，就诊时大多较晚，手术切除率低、生存期短、治愈率低，严重威胁我国人民的健康和生命安全。早期诊断和早期治疗对于HCC 患者十分重要，尤其是对改善患者预后意义重大[2]。虽然早发现、早诊断能提高肝癌患者生存率，但目前的影像学检查和病理检查准确性和敏感性存在一定程度的不足，而普通的血清肿瘤标志物诊断效果较差，因此，如何高效准确筛查早期肝癌患者，并评估患者预后和治疗方案选择是当前医学的重要课题[3]。监测肝癌患者外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC），可以有效辅助诊断肿瘤复发转移、评估预后和选择治疗方案。本研究拟采用CytoSorterCTC 检测系统对HCC 患者外周血CTC 进行检测，探索间质表型循环肿瘤细胞（mesenchymal circulating tumor cell，MCTC）用于肝癌患者辅助诊断的临床意义和诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2019 年3 月—2020 年9 月期间浙江金华广福医院收治的48 例疑似肝癌患者，经病理学检查确诊35 例HCC、13 例良性肝病，其中男43例，女5 例；年龄20～72 岁，平均年龄57.8 岁。按照中国肝癌分期方案（China liver cancer staging，CNLC）[4]，确诊肝癌患者包括Ⅰa-Ⅰb 期7 例，Ⅱa-Ⅱb 期5 例，Ⅲa 期6 例，Ⅲb 期17 例。确诊肝癌患者中肝炎疾病患者15 例，非肝炎疾病患者20 例。同时选取在我院检查的13 名健康体检者作为阴性对照。本次研究由我院医学伦理委员会审查通过（伦理批件号：ZJJHGFYY-2020-002）。患者及家属均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）未经治疗的疑似肝癌患者；（2）患者无手术、介入治疗、放疗、靶向治疗等禁忌证。排除标准：（1）智力或精神障碍；（2）无法配合此次临床研究。

1.3 研究方法 所有入组确诊肝癌患者分别在治疗前2 天与治疗后7～10 天，经肘静脉采集外周血样本8～10mL，取出初始2mL 外周血，贮存于含有EDTA抗凝剂的真空采血管内，将标本室温放置，24h 内寄往杭州华得森生物技术有限公司进行MCTC 富集检测。分析治疗前和治疗后MCTC 计数检测结果。治疗后通过电话、邮件、复查等方式随访，观察治疗后生存与复发情况，并分析治疗后MCTC 检测结果与治疗效果、生存期和复发的相关性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 统计软件对数据进行统计分析，计数资料采用百分率（%）表示，MCTC 数量与肝癌患者临床病理特征的相关性分析采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌患者MCTC 检测结果 采用CytoSorter微流控芯片循环肿瘤细胞检测系统结合CSV 捕获抗体，可以高效富集检测肝癌患者的外周血MCTC，如图1 所示。MCTC 是被鉴定为CSV（FITC，绿色）阳性、Hoechst（蓝色）阳性、CD45（PE，橙色）阴性的细胞。黄色箭头表示的细胞即为MCTC。

图1 肝癌CTC 免疫荧光染色检测结果（比例尺代表10μm，×20）

图2 肝癌、肝部良性疾病和健康人群外周血MCTC 检测结果比较

2.2 肝癌治疗前后MCTC 水平与临床病理特征相关性分析 对初始行手术、介入、放疗、靶向等治疗的肝癌患者，治疗前后分别进行外周血MCTC 检测，将治疗前后MCTC 数量分别与患者性别、年龄、CNLC分期、HbsAg 状态、血管侵犯、淋巴结转移、远端转移、甲胎蛋白（AFP）水平进行相关性分析，实验结果显示，治疗前MCTC 水平与患者性别、年龄、肿瘤直径无显著相关性，但与患者AFP 水平（P=0.010）、HbsAg 状态（P=0.003）、肿瘤数量（P=0.0150）、CNLC 分期（P=0.035）、血管侵犯（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.005）和肿瘤远端转移（P=0.000）具有显著相关性；治疗后7～10 天MCTC 水平与患者性别、年龄、CNLC分期、血管侵犯无显著相关性（P＞0.05），但与患者AFP 水平（P=0.037）、HbsAg 状态（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.019）和肿瘤远端转移（P=0.001）具有显著相关性。治疗前转移性肝癌患者CTC 检测率为100%（15/15），MCTC 检出数量范围1～37 个/5mL，平均MCTC 检出数量5.9 个/5mL，中位MCTC 检出数量为9 个/5mL；治疗后转移性肝癌患者MCTC 检测率为80%（12/15），MCTC 检出数量范围0～19 个/5mL，平均MCTC 检出数量2.4 个/5mL，中位MCTC检出数量为3 个/5mL；MCTC 可能更好反映肝癌肿瘤远端转移状态。见表1。

表1 35 例肝癌患者治疗前后MCTC 水平与临床病理特征相关性分析

2.3 MCTC 与AFP 辅助肝癌临床诊断分析 分别使用MCTC、AFP 和MCTC 联合AFP 对初诊肝癌患者进行受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析（见图3），结果显示，单独使用MCTC 作为诊断指标，cutoff 设定为1 时，可以很好地区分肝癌患者和非肝癌患者，敏感性和特异性最佳，AUC=0.8815，P<0.0001。单独使用AFP，AUC=0.6735，P=0.01993。MCTC 联合AFP 检测，AUC=0.8524，P<0.0001。MCTC 相对于AFP 可以更好的用于肝癌初诊患者的鉴别诊断。

图3 MCTC 与AFP 及其联合检测辅助肝癌诊断ROC 曲线

2.4 肝癌患者治疗前后MCTC 数量及其变化 35例肝癌患者治疗前，治疗后7～10 天均进行了MCTC检测。治疗前MCTC 数量与治疗后MCTC 数量存在显著差异（P＜0.001），治疗后MCTC 数量减少，临床疗效评估结果显示大部分患者疾病得到缓解。见图4-5。

图4 治疗前后肝癌患者MCTC 检测结果对比

3 讨论

CTC 临床应用的瓶颈在于其富集技术，CellSearch 系统是唯一通过美国FDA 批准用于临床CTC 检测的方法，其基本原理是基于上皮细胞黏附因子（Epithelial cells adhesion molecule，EpCAM）抗体捕获上皮表型CTC，该方法对肝癌CTC 检测在临床应用具有极大的局限性，其灵敏度较低（约20%～40%）[5]。Kelley 等[6]采用CellSearch 系统对肝癌外周血CTC 进行检测，但结果显示检出率仅为30.5%。虽然肝癌细胞同样属于上皮性细胞，但EpCAM 仅在约35%的肝细胞肝癌中表达。有研究表明，从肿瘤原发灶脱落进入血液循环的CTC 会发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），转变成间质型细胞的CTC 失去了EpCAM 抗原，同时，MCTC拥有类似干细胞的特性，具有更强的侵袭性和迁移能力，这是肿瘤复发转移的重要原因[7]。Satelli 等[8]验证了细胞表面波形蛋白（cell surface vimentin，CSV）抗体能够有效的捕获外周血MCTC，相比于CellSearch 系统的EpCAM 抗体，其对MCTC 具有更高的敏感性和特异性。该团队进一步研究证实，基于CSV 抗体的MCTC 检测对于肝癌预后评估具有更好的辅助指导价值[9]。本研究采用CytoSorter微流控纳米芯片CTC 检测系统结合CSV 捕获抗体，特异性富集初诊肝癌患者外周血MCTC，结果显示其敏感性为82.86%（29/35），相较与以往的富集技术对肝癌CTC检出，CytoSorterCTC 检测系统具有检出效率更佳。

图5 治疗前后肝癌患者MCTC 检测结果变化趋势

冯锦城等[10]通过采用CTC 和AFP 诊断肝癌患者，认为CTC 对肝癌的诊断效能要优于AFP，且肝癌患者血液CTC 水平明显高于良性肝病患者。本研究结果显示，肝癌患者外周血CTC 数量显著高于健康体检者和良性肝病患者（P＜0.01），这对于肝癌患者的辅助诊断和早期筛查预警具有重要的意义。

血行转移是肝细胞肝癌最常见的转移方式。Jin等[11]研究了肝细胞癌患者术前和术后外周血CTC 的表达情况，发现术前CTC 表达阳性，术后复查多数会发生肝内和肝外转移，且CTC 表达阳性，认为CTC阳性可以作为肝癌术后复发转移的预测因子。本研究通过对是否发生肝癌转移的HCC 患者MCTC 检出个数的比较，发现肝癌转移HCC 患者MCTC 检出率和检出数量明显高于未发生转移的HCC 患者，二者差异具有统计学意义（P=0.0001），表明不同阶段的肝癌患者外周血MCTC 数量不同，且随着癌症的恶化而逐渐增多，提示监测肝癌患者MCTC 能够判断患者疾病进展和转移情况。

我们对35 例HCC 患者外周血MCTC 进行了随访研究，不同患者的MCTC 变化程度不同，整体呈现下降减少趋势，治疗前MCTC 数量与治疗后MCTC数量存在显著差异（P＜0.001），治疗后MCTC 数量普遍下降减少，临床疗效评估结果显示大部分患者疾病得到缓解。这或许跟患者的治疗情况、治疗后护理、用药指导等有关。治疗前基线MCTC 水平可以预测肝癌患者复发状况，MCTC≥1 的患者比MCTC＜1的肝癌患者更容易复发（P=0.0132），肿瘤复发时间更短。患者MCTC 数量的变化有助于实时动态监测肝癌患者疾病进展，这或许可以为肝癌患者的疗效评估和复发转移监测提供临床指导。

综合所述，本研究初步证实采用的CSV 抗体微流控纳米芯片的MCTC 富集检测技术在肝癌患者辅助诊断中具有较好的临床应用价值。肝癌患者外周血MCTC 检测有助于动态监测患者的疾病发生发展和复发转移。MCTC 检测为肝癌患者的早发现早治疗以及疗效监测提供了一定指导价值。本次研究尚存在样本量偏小的不足，且随访时间较短，为更好地探索MCTC 检测在肝癌患者中的应用价值，需要进一步放大样本量研究，同时延长随访时间。