桑葚对非酒精性脂肪性肝病模型大鼠脂质代谢的影响

蒋 焱 蒋素文 胡爱荣 孟依娜 陆佳林 何哲耘

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成为发病率最高的慢性肝病，亚洲NAFLD 的总体患病率29.62%，其中我国大陆一般人群的患病率29.81%[1-2]。NAFLD 持续进展可直接导致肝硬化等终末期肝病，而且还可影响并参与病毒性肝炎等其他肝脏疾病、脂质代谢紊乱、2 型糖尿病和动脉粥样硬化等代谢综合征各组分的发生、发展[3-4]。然而，NAFLD 及相关疾病的治疗方式和药物均无满意疗效[3，5]。桑葚是一种“药食同源”的浆果，具有多种药学效应和药用价值，对糖尿病、心血管疾病等代谢综合征有较好的防治作用[6-7]。本研究以高脂饮食诱导大鼠NAFLD 模型，探讨桑葚对NAFLD 脂质代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD 雄性大鼠60 只，体质量140～170g；购于上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004，合格证编号：20170005009340。于清洁级动物房分笼饲养，模拟24h 昼夜循环光照条件下自由摄食、饮水。实验符合动物伦理规范（2017-036）。

1.2 药物桑葚标准提取物（GMP 标准）购于西安普瑞斯生物工程有限公司（批号ZHH20190429），阳性对照护肝药异甘草酸镁注射液购于南京正大天晴制药有限公司（批号190604104）。

1.3 检测试剂与仪器 丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒购自宁波赛克生物技术有限公司（批号C010-2-1、C009-2-1），三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1）。病理组织切片机及组织包埋仪为德国Leica 公司生产，动物生化分析仪iMagic-V7 为深圳市库贝尔生物科技股份有限公司生产。

1.4 动物模型复制及分组给药 大鼠适应性饲养1周后按数字表法随机分为正常组10 只和造模组50只，正常组给予正常饲料，造模组给予高脂饲料，高脂饲料配方为10%猪油+2%胆固醇+88%基础饲料。于第8 周末取大鼠肝脏组织油红O 染色及HE 染色判断造模是否成功。于第9 周起，再将造模组大鼠随机分为模型组、桑葚低、中、高剂量组、异甘草酸镁对照组，每组10 只。实验组大鼠灌胃给予对应药物，正常组与模型组大鼠予等量生理盐水，灌胃量1mL/100g，持续6 周，并监测大鼠体质量和摄食状况。桑葚水提取物的给药剂量参照文献[8]，低、中、高剂量分别为2.5、5、10g/kg，异甘草酸镁的给药剂量为按体表面积计算相当于成人临床推荐剂量，将原液稀释至1g/L，15mL·kg-1·d-1[9]。

1.5 标本留取 第14 周末用药周期完成后，所有大鼠禁食12h，以10%水合氯醛3mL/kg 腹腔注射麻醉。下腔静脉采血2mL，离心5min（离心转速=3000rpm、半径=7cm）后取血清，用于肝功能及血脂检测。开腹取出肝脏称重，并拍照大体观，观察肝脏大小、形态、色泽、边缘等情况，计算肝脏指数（肝湿重/体质量×100%）。部分肝脏组织以10%中性甲醛缓冲液固定，行油红O 染色及HE 染色。

1.6 指标测定 肝脏组织固定后，常规石蜡包埋，5μm 切片，油红O 染色观察肝组织中的脂滴分布状况，HE 染色观察肝脏病理学改变。血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C 等指标检测参照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行分析，所有数据以均数±标准差（）表示。多组间比较用单因素方差分析及两两比较，分析前行方差齐性检验，方差齐时用SNK 法，方差不齐时用Tambane's法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏大体观 正常组大鼠肝脏色泽红润、边缘锐利，模型组的肝脏体积增大、色泽较为灰白、边缘变钝，各干预组肝脏大体色泽的红润度均有一定改善，以桑葚高剂量组的改善最为明显。见图1。

图1 大鼠肝脏大体观

2.2 各组大鼠肝脏指数比较 与正常组比较，模型组、桑葚低、中、高剂量组、异甘草酸镁对照组的肝脏指数均降低（P 均<0.01）。与模型组比较，而各药物干预组肝脏指数均升高；桑葚中、高剂量组及异甘草酸镁对照组的改善最为显著（P<0.01 或P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肝脏指数比较（）

表1 各组大鼠肝脏指数比较（）

注：正常组与模型组给予等量生理盐水；桑葚低、中、高剂量组分别予2.5、5、10g·kg-1·d-1 水提取物灌胃；异甘草酸镁对照组予15mL·kg-1·d-1异甘草酸镁灌胃；与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与桑葚低剂量组比较，cP<0.05，ccP<0.01

2.3 各组大鼠肝组织病理改变 油红O 染色可特异性显示肝组织内的脂肪沉积程度，脂滴呈红色，细胞核蓝色。正常组肝细胞形态正常，未见任何脂滴。模型组肝细胞油红O 染色强阳性，红色脂滴片状聚集，脂滴细胞数/总细胞数为60%～70%。桑葚低剂量组及中剂量组仍可见一定程度的脂肪沉积，脂滴细胞数/总细胞数分布为20%～30%、10%～15%，且随着桑葚剂量的增加而逐渐改善。桑葚高剂量组及异甘草酸镁对照组肝脏脂肪沉积显著改善，与正常组接近。见图2。

图2 各组大鼠肝组织脂滴分布状况（油红O 染色法）

HE 染色正常组肝细胞形态正常，大小均匀，肝索呈放射状整齐排列，肝小叶结构清晰完整，未见任何病理改变。模型组肝细胞肿大，胞浆疏松，胞浆内可见脂滴空泡将细胞核挤向一边，严重者出现气球样变，肝索排列紊乱，汇管区可见一定的炎性细胞浸润。与模型组相比，各干预组均有不同程度改善。桑葚低、中剂量组仍可见脂滴空泡，但肝索排列及细胞肿大较模型组改善。桑葚高剂量组及异甘草酸镁对照组肝细胞脂肪变性明显改善，细胞核大小较正常，肝索排列较整齐，优于桑葚低、中剂量组。见图3。

图3 各组大鼠肝组织病理改变（HE 染色）

2.4 各组大鼠血清肝功能及脂质代谢指标比较 与正常组比较，模型组血清ALT、AST 显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各干预组大鼠血清ALT、AST均明显降低（P 均<0.01）；桑葚干预组的改善呈剂量依赖性，以桑葚高剂量组的疗效改善最为显著，与正常组相近，桑甚高剂量组与正常组两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC 及LDL-C 均明显升高（P<0.01），HDL-C明显降低（P<0.05）。与模型组比较，桑葚低、中、高剂量组及异甘草酸镁对照组血清TG 与LDL-C 均显著下降（P<0.01），桑葚高剂量组及异甘草酸镁组血清TC 显著下降（P<0.01），桑葚低、中剂量组血清HDLC 显著上升（P<0.01，P<0.05）。与异甘草酸镁组比较，桑葚高剂量组血清TG、LDL-C 下降更明显（P 均<0.01），桑葚低、中剂量组血清HDL-C 上升更明显（P<0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清肝功能及脂质代谢指标比较（）

表2 各组大鼠血清肝功能及脂质代谢指标比较（）

注：正常组与模型组给予等量生理盐水；桑葚低、中、高剂量组分别予2.5、5、10g·kg-1·d-1 水提取物灌胃；异甘草酸镁对照组予15mL·kg-1·d-1 异甘草酸镁灌胃；ALT 为丙氨酸转氨酶；AST 为天冬氨酸转氨酶；TG 为三酰甘油；TC 为总胆固醇；LDL-C 为低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C 为高密度脂蛋白胆固醇；与正常组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与异甘草酸镁对照组比较，cP<0.05，ccP<0.01

3 讨论

NAFLD 与胰岛素抵抗、遗传易感性和糖脂代谢紊乱等因素密切相关，为多系统代谢功能异常累及肝脏的表现[10]。因此，最近多位国际脂肪肝领域的临床专家联合建议将NAFLD 更名为代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）[11]。随着肥胖及相关疾病的全球化流行，NAFLD 已经成为严重危害健康的常见病、多发病，并已成为我国最常见慢性肝病[12]。然而目前尚无明确的药物被推荐用于治疗NAFLD[3，5]，其治疗药物的研发依然任重道远。

桑葚的营养价值和药用价值较高，含有花青素、黄酮类、多糖、白藜芦醇、生物碱等生物活性物质，具有补肝益肾、滋阴养血和延缓衰老的功效[6]。桑葚可应用于多种疾病的防治，如脂质代谢紊乱、糖尿病、癌症、心血管疾病和阿尔兹海默病等[6-7]。

作为肥胖及代谢综合征的一个组分，NAFLD 的发生发展常伴随着脂质代谢的异常（高脂血症及肝脏脂质沉积）[3，5，10]。由于肝脏脂肪的聚积和沉积，使得NAFLD 大鼠的肝脏体积增大、色泽变得灰白，肝脏指数相应降低，肝组织油红O 染色强阳性提示肝内TG 显著聚积，HE 染色提示肝细胞内脂滴空泡和气球样变显著。而桑葚能减轻肝脏脂质沉积，使脂滴空泡明显减少，改善肝脂肪变，并不同程度降低血清TG、TC、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平；ALT 及AST水平亦不同程度降低；且桑葚高剂量组降低TG、LDL-C 的作用，低、中剂量组提升HDL-C 的作用优于异甘草酸镁对照组。提示桑葚能够改善脂质代谢，其对心血管疾病的保护亦是该作用的印证[13]。研究表明，桑葚可减轻实验大鼠肝脂肪变性、动脉内膜中层厚度和动脉粥样硬化病变，认为可能与桑葚中花青素（23.75%）、多酚（2.95%）和黄酮类化合物（0.94%）的协同作用相关[13]。桑葚改善脂质代谢的作用可能是建立在调节LDL-C 受体基因表达和LDL-C 清除能力、抑制脂质生物合成以及调节胆固醇逆向转运的基础上[14]。

综上，本实验结果表明，桑葚对高脂饮食诱导NAFLD 大鼠的脂质代谢（血脂水平、肝内脂质沉积、肝脂肪变等）具有良好的改善作用。