CD4+T细胞、NK细胞穿孔素异常表达对手足口病免疫状态评估及预后的指导价值

黄崇刚 陈静琳 喇海芹

青海省妇女儿童医院呼吸科（西宁810007）

手足口病（HFMD）是一种由肠道病毒感染引发的儿童传染病，病原体主要为肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）病毒［1］。HFMD大多预后良好，但部分病情较重者可在短时间内出现急性肺水肿、神经系统并发症甚至死亡。多项研究表明，免疫功能紊乱在HFMD的发生发展中起到重要作用，寻找到一种评估HFMD患儿免疫状态和病情严重程度的敏感指标，对指导临床治疗和改善预后具有重要意义［2］。有研究认为，EV71病毒蛋白表型A3可能是诱导CD4+T细胞活化的主要决定簇，在病毒后期蛋白加工过程A3重新修饰可能会影响CD4+T细胞的增殖状态，因此CD4+T细胞表达或许能反映HFMD的病情发展［3］。NK细胞穿孔素（PRF）能协助颗粒酶进入靶细胞清除病原体，有学者认为其表达能在一定程度上反映病毒感染程度和预测预后［4］，但具体情况有待进一步研究。本研究通过分析143例EV71型HFMD患儿 体内CD4+T细 胞、NK细胞PRF表 达水平与免疫状态和预后关系，为探索HFMD发病机制及改善患儿预后提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月至2020年6月我院收治的143例EV71型HFMD患儿，纳入标准：（1）患儿确诊为HFMD，参考《手足口病诊疗指南（2018年版）》［5］；（2）病程≤3 d；（3）临床资料完善；（4）患儿家长知情并签署同意书。排除标准：（1）合并慢肺阻、先天性心脏病、营养不良等基础疾病；（2）合并严重肾脏相关疾病；（3）外院转入或用药史不详患儿；（4）近期有使用过免疫抑制剂或注射免疫球蛋白者。入选患儿按照病情严重程度［6］分为普通型组（n=67）、重型组（n=45）和危重型组（n=31），同时按照性别、年龄匹配原则另选体检正常儿童35例作为对照组，且肠道病毒抗体阴性，无严重器质性疾病、代谢异常等。普通型组，男37例，女30例，年龄（1.82±0.92）岁，病程（1.63±0.25）d，其中27例EV71感染，22例CA16感染，18例通用病毒感染；重型组，男24例，女21例，年龄（1.77±0.86）岁，病程（1.72±0.33）d，其中25例EV71感染，13例CA16感染，7例通用病毒感染；危重型组，男17例，女14例，年龄（1.73±0.91）岁，病程（1.86±0.36）d，其中22例EV71感染，7例CA16感染，2例通用病毒感染；对照组，男20例，女15例，年龄（1.72±0.83）岁。各组患儿性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方法收集患儿一般临床资料，如性别、年龄、病程、感染病原体（经肛门拭子和咽拭子RT⁃PCR检测确定病毒类型）及各项生理指标参数。于入组第1天采集患儿空腹静脉血4 mL并置于加入EDTA的抗凝管中，采用全血法配置分析液，FACS Multi SET程序获得T淋巴细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T）、CD14+单核细胞、CD19+B细胞、NK细胞的绝对计数。将全血采用免疫比浊法检测血清中疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）及补体（C3、C4）水平。在分离出的单个核细胞中加入表面抗体anti⁃CD56⁃APC（CD3+CD8+CTL细胞和CD3⁃CD56+NK细胞）进行染色，固定、破膜。洗涤后加入PE标记的PRF或颗粒酶B（GrzB）抗体，避光孵育1 h，洗涤，上流式细胞仪（美国BD公司Facs CantoⅡ型）检测，以PRF或GrzB阳性细胞比率作为PRF或GrzB表达水平。采用小儿危重病例评分（PCIS）、小儿死亡危险评分（PRISMⅢ）评价患儿病情严重程度，PCIS评分包括患儿心率、血压、血气值、pH、血钠、血 钾、有 无 应激 性 溃疡 等 内容，总分100分［7］；PRISMⅢ评分包括体温、心率、瞳孔反射、血压、血气值、血钾、血细胞计数等26个生理参数［8］，两者均为分数越高病情越严重，死亡风险越高。将入院28 d内死亡作为预后不良，分析不同预后患儿CD4+T、NK细胞PRF表达差异。所有患儿均由我院2名副主任及以上级别医师进行疾病诊断和病情评估。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件包分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用snk⁃q检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组T细胞、单核细胞水平比较重症组、危重型组、普通型组患儿CD3+T、CD4+T、CD14+细胞数低于对照组，其中重症组、危重型组低于普通型组，差异具有统计学意义（P<0.05），重症组、危重型组、普通型组患儿CD8+T细胞数组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 各组免疫细胞水平比较Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

表1 各组免疫细胞水平比较Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通型比较，#P<0.05

组别危重型组重型组普通型组对照组例数31 45 67 35 CD4+T 630.2±126.7*#1 026.7±163.8*#1 137.5±149.5*1 682.2±123.4 CD3+T 1 776.2±384.2*#2 169.4±391.5*#2 483.2±368.7*3 794.2±494.3 CD8+T 764.2±170.8*796.3±124.2*834.2±253.6*1 174.2±493.5 CD14+340.5±74.7*#426.2±68.2*#473.6±56.9*759.2±38.4

2.2 各组B细胞、IgA、IgG、IgM及补体水平比较各组体液免疫指标IgA、IgG、IgM及补体C3、C4水平差异无统计学意义（P>0.05），重症组、危重型组、普通型组患儿CD19+B细胞数低于对照组，其中重症组、危重型组低于普通型组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组B细胞、IgA、IgG、IgM及补体水平比较Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

表2 各组B细胞、IgA、IgG、IgM及补体水平比较Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通型比较，#P<0.05

组别危重型组重型组普通型组对照组例数31 45 67 35 CD19+（个/mL）604.5±135.7*#755.4±132.4*#820.7±276.8*1 101.4±362.5 IgA（g/L）0.98±0.24 1.01±0.25 1.12±0.26 1.04±0.17 IgM（g/L）1.20±0.24 1.13±0.18 1.24±0.21 1.12±0.30 IgG（g/L）9.84±35.4 10.20±1.89 9.29±1.15 9.16±1.29 C3（g/L）0.97±0.11 0.94±0.15 1.02±0.16 0.99±0.12 C4（g/L）0.19±0.07 0.16±0.06 0.21±0.08 0.18±0.05

2.3 各组NK细胞及PRF、GrzB水平比较重症组、危重型组、普通型组患儿NK细胞数低于对照组，其中重症组、危重型组低于普通型组，PRF、GrzB反之，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各组NK细胞及PRF、GrzB水平比较Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

表3 各组NK细胞及PRF、GrzB水平比较Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通型比较，#P<0.05

组别危重型组重型组普通型组对照组例数31 45 67 35 NK细胞（个/μL）376.4±71.5*#390.4±43.2*#422.8±86.9*609.3±105.4 PRF（%）87.2±7.64*#75.6±10.1*#70.5±13.4*55.3±12.7 GrzB（%）92.4±6.5*#83.9±7.0*#79.2±8.2*57.2±13.4

2.4 CD4+T细胞、PRF与PCIS评分、PRISMⅢ评分相关性分别评价重症和危重症患儿病情严重程度，其PCIS评分分别为（78.35±6.84）、（70.84±6.34）分，PRISMⅢ评分分别为（7.29±2.71）、（12.84±3.56）分。Pearson相关性分析显示，CD4+T细胞与PCIS评分呈正相关（r=0.665，P<0.05），与PRISMⅢ评分呈负相关（r=-0.757，P<0.05），PRF与PCIS评分呈负相关（r=-0.615，P<0.05），与PRISMⅢ评分呈正相关（r=0.596，P<0.05），见表4。

2.5 CD4+T细胞、PRF表达与临床预后预后良好患儿CD4+T细胞高于预后不良患儿，NK细胞PRF低于预后不良患儿，差异具有统计学意义（P<0.05），见表5。

表4 CD4+T细胞、PRF与PCIS评分、PRISMⅢ评分相关性Tab.4 The correlation between CD4+T cells，PRF and PCIS score，PRISMⅢscore

表5 不同预后患儿CD4+T细胞、PRF表达Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

表5 不同预后患儿CD4+T细胞、PRF表达Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

组别预后良好预后不良t值P值例数112 31 CD4+T（个/mL）1 126.7±163.8 652.3±142.7 14.6516<0.001 PRF（%）65.6±12.1 42.8±9.5 9.689<0.001

3 讨论

HFMD是常见的儿童肠道病毒感染疾病，部分患儿病情发展严重可并发心肺衰竭、神经源性肺水肿等，引发患儿病死［9-10］。目前HFMD发病机制尚未明确，但已有多项研究证实细胞免疫在其中发挥作用。肠道病毒感染机体内，体内T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫细胞可迅速分化，从而释放大量炎性因子或炎性介质，而过度活化的免疫应答损伤患儿肺部、大脑、神经等组织或脏器，对患儿预后产生不利影响［11］。

相关研究发现，在肠道病毒感染早期机体内可出现细胞免疫紊乱、分泌细胞因子大量增加、代偿性抗炎反应强度增加，随着病情持续发展，免疫细胞和炎症介质逐渐消耗，患儿机体内免疫细胞数量开始减少，出现免疫抑制或免疫麻痹［12-13］。本次研究发现，HFMD患儿CD3+T、CD4+T、CD14+、CD19+B、NK细胞数及NK细胞PRF、GrzB均低于正常儿童，其中重症、危重型患儿以上指标均低于普通型患儿，提示HFMD患儿体内存在明显单核细胞、淋巴细胞数量的减少，且重型和危重型患儿减少更为明显。而不同病情严重程度患儿IgA、IgG、IgM及补体C3、C4水平无显著差异，提示随病情进展，患儿体内出现明显的细胞免疫功能抑制，因而可以说明细胞免疫异常也参与了HFMD的病情进展。CD4+T是机内常见免疫细胞，其绝对值与患儿年龄有关［14］，本次选择各组患儿年龄无显著差异，发现不同病情患儿体内CD4+T细胞数具有显著差异，且重症、危重症患儿CD4+T细胞数目低于普通型患儿。一般来说，机体免疫细胞在病毒感染刺激下可迅速被激活，产生大量细胞因子来清除病毒［15］，而本次结果提示病情越重，CD4+T细胞表达抑制越严重。推测原因可能是在肠道病毒复制的过程中，能被CD4+T细胞识别的表型被重新修饰而引发CD4+T细胞受刺激和表达减少［16］。有学者认为，CD4+T细胞对主要肠道感染病毒EV71和CA16感染并不敏感，因而CD4+T细胞并未随病情进展持续增加［17］。还有学者认为，病毒感染刺激后机体免疫系统可能出现偏倚，即CD4+T细胞作用降低的同时，机体其他免疫细胞（如NK细胞）对该病毒更为敏感，杀伤作用增强［18］，但本次研究中其他淋巴细胞也减少，故此结论有待进一步研究和论证。NK细胞作为机体免疫系统的第一道防线，也在肠道病毒感染过程中发挥重要作用［19］。NK细胞对病毒杀伤机制主要有两点，一是调节T细胞表面抗原配体和Fas靶细胞表面抗原之间作用，二是细胞释放PRF后可与靶细胞膜结合，PRF嵌入膜内形成中空多聚体，损伤胞膜完整，外界水分子、离子及其他小分子物质进入靶细胞内，影响细胞渗透压从而破裂死亡［20-21］。PRF同时也协助颗粒酶通过颗粒胞吐作用进入靶细胞，并诱导细胞核caspases的非依赖性细胞死亡，因而PRF、GrzB表达升高有利于抗病毒作用［22］。而本研究中相对于重症患儿，普通型患儿PRF、GrzB表达升高，提示其介导的细胞杀伤和细胞毒性作用也相应增加。推测原因可能是重症患儿免疫功能不足，引发病毒大量复制和扩散，PRF、GrzB介导的细胞杀伤和细胞毒性作用增强，炎症因子释放引发组织损伤，从而进一步加重患儿病情［23］。相关性分析显示，CD4+T细胞与PCIS评分呈正相关，与PRISMⅢ评分呈负相关，PRF反之，提示CD4+T细胞与PRF均与患儿病情严重程度密切相关。根据入院28 d是否死亡将患儿分为预后良好和预后不良，发现预后良好患儿CD4+T细胞高于预后不良患儿，NK细胞PRF低于预后不良患儿，提示CD4+T细胞与PRF能在一定程度上反映HFMD患儿预后。

综上所述，手足口病患儿存在明显CD4+T细胞表达过低、NK细胞PRF表达过高，两者可用于重症患儿细胞免疫状况评估，且与患儿病情严重程度和预后不良有关。