糖蛋白丝甘蛋白聚糖促进卵巢癌细胞的化疗耐药和转移

邓晓芳 彭俊琴 陈历排 卢斌贵

广州医科大学附属肿瘤医院1内科二区，2医学影像科，3妇瘤科（广州510095）

卵巢癌是继宫颈癌及子宫内膜癌之后发生率居第三位的妇科恶性肿瘤，其死亡率一直居女性生殖道恶性肿瘤的首位［1］。早期卵巢癌经手术及化疗后，其5年生存率达80%～95%，而中晚期卵巢癌仅为20%～30%。癌细胞减灭术联合化疗是目前中晚期卵巢癌的标准治疗方案。尽管治疗手段不断发展，但中晚期卵巢癌患者的预后和死亡率仍未得到明显改善，原因在于化疗耐药和转移［2］。

糖蛋白丝甘蛋白聚糖（Serglycin）是一种小分子蛋白多糖，在造血细胞和内皮细胞中最早发现，参与炎症介质的储存和分泌［3-4］。最近有报道指出Serglycin参与多种肿瘤细胞的耐药和转移［5-6］，但Serglycin在卵巢癌中的作用鲜有报道。本研究拟在人卵巢癌SKOV3细胞株中，通过构建稳定干扰Serglycin低表达的细胞株，探究Serglycin与卵巢癌耐药及转移的关系，为阐明卵巢癌耐药及转移的分子机制和改善晚期卵巢癌的临床治疗效果提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌细胞系SKOV3购于美国ATCC。培养基为RPMI⁃1640，含10%胎牛血清，将细胞置于5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中培养。取对数期的细胞进行实验。Serglycin基因的shRNA干扰慢病毒购于上海吉凯基因。cDNA逆转录试剂盒及实时定量PCR试剂购于美国Fermentas公司。由华大基因合成引物。Serglycin、β⁃actin抗体购于美国Santa Cruz。Ecadherin、ZEB1/2抗体购于美国Cell Signal⁃ling公司。ECL化学发光检测试剂盒购于美国Pierce公司。顺铂（cDDP）购置美国Sigma公司。Transwell小室购置美国Corning公司。

1.2 构建敲低Serglycin稳定细胞系利用shRNA干扰技术，构建稳定敲低Serglycin基因的两株细胞系：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#，及对照细胞株：SKOV3/shCon。具体为接种适量SKOV3细胞于24孔板中，待细胞生长达60%～80%时将1 mL的shSerglycin1#、shSerglycin2#慢病毒液和阴性对照的shCon分别加入24孔板中的SKOV3细胞中，置于培养箱中感染48 h，后将细胞转至6孔板，并用2 μg/μL的嘌呤霉素筛选稳定细胞株。

1.3 实时定量PCR检测Serglycin的表达取对数生长期的SKOV3/shSerglycin1#、SKOV3/shSergly⁃cin2#和空白对照组SKOV3/shCon细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。以GAPDH为内参，进行实时定量PCR，所有实验独立重复3次。Sergly⁃cin的引物序列是：FP：5′⁃TCCAACAAGATCCCCC⁃GTCT⁃3′，RF：5′⁃TTCCGTTAGGAAGCCACTCC⁃3′。

1.4 蛋白质免疫印迹（Western blot）用RIPA裂解液裂解上皮卵巢癌细胞，BCA法检测蛋白含量，于100℃蛋白变性。用10%SDS⁃PAGE胶进行蛋白垂直电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4℃摇床孵育抗体过夜，TBST溶液洗膜3次，用HPR标记二抗，然后在室温下孵育条带1 h，在暗室内用ECL发光试剂显影。

1.5 卵巢癌细胞SKOV3药物敏感性检测取3×103个细胞接种于96孔板中，24 h后依次加入梯度浓度（0、3、6、9、12、15 μmol/L）的含化疗药物顺铂（cDDP）的RPMI⁃1640培养基。化疗作用48 h后，每孔加入20 μL MTS试剂，37℃继续孵育2.5 h，酶标仪测定OD值。计算各组细胞的存活率，绘制细胞生长曲线图。

1.6 体外肿瘤细胞侵袭实验用无血清的培养基制备1×105个/mL的细胞悬液，吸取0.5 mL的细胞悬液于铺胶Transwell小室内，置于恒温箱中孵育36 h，然后吸掉小室里的液体，小心擦拭掉上室面的细胞，用PBS洗涤3次，用甲醇固定迁移到膜下室面的细胞30 min，然后用1%结晶紫染色10 min，漂洗，晾干后在显微镜下观察迁移后的细胞数量并拍照记录结果。

1.7 生物信息学分析利用TCGA数据库（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/index.html）和在线预后分析软件（http：//kmplot.com），分析Serglycin在卵巢癌中的表达及与卵巢癌患者的预后关系。

1.8 统计学方法采用Prism 5.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 敲低Serglycin增强卵巢癌细胞SKOV3的化疗敏感性qRT⁃PCR及Western blot结果显示：shSerglycin1#和shSerglycin2# mRNA和蛋白质相对表达量均低于对照组，而shSerglycin1# mRNA和蛋白质相对表达量均低于shSerglycin2#（图1A、B）；MTS法检测结果显示：相对于对照组，不同梯度浓度化疗药物处理的shSerglycin1#卵巢癌细胞存活率均低于对照组（图1C），表明敲低Serglycin可增强卵巢癌细胞的化疗敏感性。

图1 敲低Serglycin与shCont卵巢癌细胞的化疗敏感性比较Fig.1 Chemotherapy sensitivity of Serglycin knockdown versus control ovarian cancer cells

2.2 敲低Serglycin抑制卵巢癌细胞的侵袭转移Transwell小室实验结果发现，敲低Serglycin基因的SKOV3细胞穿过基质胶的细胞数为（42±4.3）个/视野，而对照组的穿过基质胶细胞数是（141.3±5.6）个/视野（图2A）。与对照组相比，敲低组的穿膜细胞数明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.01），表明Serglycin可明显促进卵巢癌SKOV3细胞的侵袭、转移（图2B）。

图2 敲低Serglycin卵巢癌细胞与shCont侵袭转移力的比较Fig.2 Knock down Serglycin inhibit invasion and metastasis of ovarian cancer cells

2.3 Serglycin促进卵巢癌细胞的EMT的改变Western blot检测显示，相对于对照组shCont，shSer⁃glycin1#SKOV3细胞系间质细胞标志物Vimentin蛋白表达降低，而上皮细胞标志物Ncadherin蛋白表达升高，同时EMT相关转录因子ZEB2表达明显降低（图3A）。TCGA数据库分析发现在卵巢癌组织标本中Serglycin表达与CDH2（编码Ncadherin蛋白）表达呈负相关（r=-0.099，P=0.041），与VIM表达（编码Vimentin蛋白）呈正相关（r=0.19，P<0.001），而且与ZEB2表达呈正相关（r=0.6，P<0.001，图3B）。

图3 Serglycin干扰后卵巢癌细胞的EMT的改变Fig.3 EMT changes in ovarian cancer cells after Serglycin interference

2.4 Serglycin可作为卵巢癌的预后指标和治疗靶点分析TCGA数据库中卵巢癌数据集，在426例卵巢癌组织中，Serglycin表达显著高于正常卵巢组织（P<0.05）。KMPLOT进一步分析在卵巢癌患者中Serglycin与预后的关系，Serglycin表达与卵巢癌患者预后呈负相关，Serglycin高表达的患者总生存期较差（平均危险指数：HR=1.26，P<0.001），提示Serglycin可作为卵巢癌一个潜在的治疗和预后靶点。见图4。

3 讨论

图4 Serglycin在卵巢癌的表达和预后的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of Serglycin expression and prognosis in ovarian cancer

Serglycin是一种主要分布在细胞内的小分子量糖蛋白，也可以分泌和整合到细胞外基质中。其由核心蛋白和附着在其上的多种粘多糖（GAG）组成，根据结合的粘多糖的类型分为：硫酸软骨素类，如CS⁃4、CS⁃6、CS⁃B和肝素类（heparin/heparin sulfate）［6-7］。细胞内的Serglycin通过调节血管内皮生长因子、蛋白水解酶、TGF⁃β、IL⁃8和HGF等分子的释放，进而激活多条级联信号通路，促进肿瘤细胞增殖和转移、上皮间充质转化（EMT）以及肿瘤细胞干性的维持［8-12］。分泌到细胞外的Serglycin可作为配体与其受体CD44分子结合，进而促进肿瘤的多种恶性行为，如侵袭转移、耐药、上皮间充质转化（EMT）等［13-14］。近期研究也发现Serglycin可通过分泌依赖机制参与三阴性乳腺癌（TNBC）［15-16］、鼻咽癌等多种肿瘤的化疗耐药与转移［17］。

shRNA干扰是真核生物体内由双链RNA介导的降解同源RNA的现象，能特异性抑制靶基因表达，对基因发生转录后进行调控，广泛应用于基因功能研究［18］。本研究中，构建了2个干扰序列：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#以及相应的空白载体：SKOV3/shCon。并在mRNA水平和蛋白质水平验证了其敲低效率，显示shSerglycin1#降低Serglycin效果明显。进一步用不同浓度梯度的化疗药物顺铂进行处理，发现相对于对照组，敲低Serglycin表达可在不同程度上增强卵巢癌细胞SKOV3对化疗药物的敏感性。

细胞的侵袭能力是衡量肿瘤细胞生物学行为的重要方面。有研究指出肿瘤细胞迁移侵袭能力与其恶性程度较为一致，受细胞自身因素及机体等因素影响。Transwell小室实验因其具有高重复性，操作简便易行，目前被广泛用于肿瘤细胞侵袭模型的建立及检测。在本研究中，Transwell小室侵袭转移实验显示，与SKOV3/shCon相比，敲低Serglycin基因的卵巢癌细胞，穿膜细胞数明显减少，表明Serglycin可明显促进卵巢癌细胞的侵袭转移能力。

EMT的发生过程中，上皮细胞失去极性，多个EMT相关转录因子被激活，间质标志物Vimentin等表达上调，上皮标志物Ecadherin等表达下调，细胞骨架重组，细胞外基质（ECM）降解酶增加，上皮细胞发生转化，进而转变为间质细胞类型［19-20］。在胚胎组织发生发育、伤口愈合、器官纤维化、肿瘤进展以及耐药性的产生等过程中EMT的调控都起了一定的作用［21］。有研究指出，靶向EMT发生可以抑制肿瘤耐药的发生［22］。本研究显示在卵巢癌组织中Serglycin可通过转录抑制因子ZEB2促进卵巢癌细胞的EMT改变，敲低Serglycin可通过EMT影响肿瘤细胞的侵袭转移和耐药。

综上所述，在卵巢癌中，高表达Serglycin与卵巢癌的侵袭转移与耐药性相关，降低Serglycin的表达可抑制卵巢癌的EMT的发生。Serglycin通过促进EMT的发生，导致卵巢癌的化疗耐药和侵袭转移。然而，Serglycin通过EMT促进耐药发生和转移的具体机制还需要继续探索。同时，本研究发现Serglycin可成为卵巢癌的预后指标和今后潜在的治疗靶点，这为临床上卵巢癌的诊治提供了新的理论基础及方案。