基于响应面分析法优化解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵条件

夏邦华,赵健,宫娉,韩小斌,彭玉龙,刘凯,汪城墙,丁延芹,杜秉海*

基于响应面分析法优化解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵条件

夏邦华1,赵健2,宫娉1,韩小斌2,彭玉龙2,刘凯1,汪城墙1,丁延芹1,杜秉海1*

1. 山东农业大学生命科学学院/山东省盐碱地植物-微生物联合修复工程技术研究中心, 山东 泰安 271018 2. 贵州省烟草公司遵义市公司, 贵州 遵义 563000

解淀粉芽孢杆菌DSYZ（）是一种重要的生防菌株，其代谢产物对多种病原菌有着拮抗作用，广泛应用于大蒜、辣椒、花生等农作物的生物防治，但是自然条件下其分泌的代谢产物浓度较低并且浓度主要与培养基的组成，培养条件以及自身诱导肽有关。因此，通过响应面分析法对发酵培养基进行优化以及提高菌株活菌数成为当前的主要目标。首先利用添加不同碳源、氮源、无机盐的豆芽汁培养基对菌株进行发酵，测定菌数，筛选出最适的碳源、氮源和无机盐。进一步通过单因素试验考察不同浓度的碳源、氮源和无机盐对菌种菌数的影响。然后通过响应面分析法对菌株的发酵培养基进行优化，得到最优的培养基组合。优化后的发酵培养基中的最优碳源是玉米粉为18.87 g·L-1，最优无机氮源是氯化铵为1.36 g·L-1，最优无机盐是磷酸二氢钾为0.47 g·L-1，优化后培养基菌数达到2.20×109cfu·mL-1，是未优化前的1.53倍。

解淀粉芽孢杆菌; 响应面分析法; 发酵培养基; 培养基优化

解淀粉芽孢杆菌DSYZ（）是一种重要的生防菌株[1]，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌等病原菌具有拮抗作用[2]。通过解淀粉芽孢杆菌DSYZ产生的代谢产物（脂肽类抗生素、挥发性物质、抗菌蛋白等活性物质）可以不同程度的抑制由病原微生物引起的植物病害[3]。除此之外，解淀粉芽孢杆菌产生的IAA、CTK和ACC脱氢酶也可以调控植物的生长[4]。目前，解淀粉芽孢杆菌DSYZ普遍应用于大蒜、辣椒、花生等农作物的生物防治[5]。虽然解淀粉芽孢杆菌DSYZ具有多种生防功能，但是自然条件下其分泌的生长素浓度较低并且浓度主要与培养基的组成，培养条件以及自身诱导肽有关[6,7]，因此，改良其液体发酵培养基成为当前的主要目标。

文献报道中，张宝俊等[8]从解淀粉芽孢杆菌LP-5代谢产物中获得一种对梨黑斑病菌（）具有较强抑制作用的抗菌蛋白。王晓辉等[9]从解淀粉芽孢杆菌K1的代谢产物中获得一种抗菌蛋白，该蛋白可有效抑制灰霉病菌（）的生长。王翠娟等[4]通过研究解淀粉芽孢杆菌YTB1407在甘薯植株上的定殖特性，及其内生定殖对甘薯生长前期根系统的作用，并初步探明其在甘薯块根分化建成中对内源生长素吲哚乙酸（IAA），细胞分裂素（CTK）含量变化及吲哚乙酸氧化酶类吲哚乙酸氧化酶（IAAO），过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的调控。桑建伟等[10]研究发现内生解淀粉芽孢杆菌BEB17分泌的活性物质具有拮抗尖孢镰刀菌古巴转化型的活性。罗楚平等[11]和刘邮洲等[12]研究发现解淀粉芽孢杆菌产生的伊枯草菌素、泛革素具有较强的抗真菌活性。Xiang等[13]研究发现分泌的泛革素及芽孢菌霉素对番茄萎焉病菌有较强的抑菌活性。Deleu M等[14]研究认为芽孢杆菌可以增强伊枯草菌素的抗真菌能力，并且在植物根系形成生物膜，保护植物不受侵染。

本研究以解淀粉芽孢杆菌DSYZ为发酵菌株，选择培养基成分为自变量，以菌数为响应值，采用响应面法优化解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵培养基，得到最优配方，为今后该菌株的工业化生产和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株解淀粉芽孢杆菌DSYZ（），由本实验室保藏。

1.1.2 培养基与试剂豆芽汁培养基：豆芽汁100 mL，蔗糖10 g，(NH4)2SO42 g，NaCl 0.4 g，ZnSO40.08 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH自然，115 ℃高压灭菌30 min。

固体LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂15~20 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH调节至7.0，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 单因素试验优化培养基

1.2.1 最适碳源优化选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和玉米粉各10 g分别作为碳源替换豆芽汁培养基中的蔗糖，其他成分不变，接种量为5%，37 ℃，180 rpm的恒温培养48 h后测定解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数，并通过改变最优碳源浓度再次培养，确定培养基中碳源的最适浓度。

1.2.2 最适氮源优化选取NH4NO3、NH4Cl和尿素各2 g分别作为无机氮源替换豆芽汁培养基中的(NH4)2SO4，其他成分不变，接种量为5%，37 ℃，180 rpm恒温培养48 h后测定解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数，并通过改变最优氮源浓度再次培养，确定培养基中氮源的最适浓度。

1.2.3 最适无机盐优化选取CaSO4、MgSO4和KH2PO4各0.4 g作为无机盐替换豆芽汁培养基中的NaCl，其他成分不变，接种量为5%，37 ℃，180 rpm恒温培养48 h后测定解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数，并通过改变最优无机盐浓度再次培养，确定培养基中无机盐的最适浓度。

1.3 响应面分析法优化培养基

基于单因素筛选的碳源、无机氮源以及无机盐的试验结果，利用响应面分析软件，以发酵培养基中解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数为优化指标，进行条件优化，从而获得最优培养基配方，并对配方进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 碳源对解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数的影响

由图1可知，在不同碳源中解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数由高到低为玉米粉>蔗糖>可溶性淀粉>麦芽糖>葡萄糖>乳糖，且玉米粉浓度为20 g·L-1时达到最高值1.52×109cfu·mL-1。相对其他碳源，玉米粉是一种复合碳源，含有玉米淀粉，以及少量氮源和其余生长因子，能够促进解淀粉芽孢杆菌DSYZ的生长。除此之外，玉米粉就其余种类碳源来说相对廉价易得，所以选择玉米粉为最佳碳源。

图1 碳源对解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数的影响

2.2 无机氮源对解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数的影响

如图2所示，在不同无机氮源中解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数由高到低依次为NH4Cl> NH4NO3>尿素>(NH4)2SO4，且在NH4Cl浓度为1.5 g·L-1时达到最高值1.42×109cfu·mL-1。相比于有机氮源，无机氮源成分相对单一，且质量更为稳定，在发酵培养基中更易被微生物快速利用。尿素虽然是有机物，但由于尿素作氮源，为培养基所提供的是铵态氮，属于无机形式的氮，因此在本实验中认为尿素属于无机氮源。本实验中所用到的无机氮源中，NH4Cl作无机氮源时解淀粉芽孢杆菌DSYZ生长情况最好，通过平板涂布计数法得到的总菌数最多，而(NH4)2SO4作无机氮源时总菌数最少。因此，在本实验中选择NH4Cl作为解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵培养基的最佳无机氮源。

图2 无机氮源对解淀粉芽孢杆菌菌数的影响

2.3 无机盐对解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数的影响

图3 无机盐对解淀粉芽孢杆菌菌数的影响

由图3可得，不同种类的无机盐对于解淀粉芽孢杆菌DSYZ的生长有着显著的影响。在不同种类的无机盐中，解淀粉芽孢杆菌DSYZ的菌数由高到低依次为KH2PO4> CaSO4>NaCl>MgSO4，且在KH2PO4浓度为0.5 g·L-1时达到最高值1.69×109cfu·mL-1。说明KH2PO4对于解淀粉芽孢杆菌DSYZ的生长有着较为明显的促生作用，故选择KH2PO4作为最优无机盐来源。

2.4 响应面分析法优化解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵培养基

在单因素试验的基础上，对解淀粉芽孢杆菌DSYZ发酵培养基设计三因素三水平的响应面分析实验方案，见表1。根据试验优化方案，安排17个试验组，对DSYZ菌数进行测定，见表2。

表 1 响应面分析因素与水平

表2 响应面分析结果

表3 Box-Behnken 实验结果的方差分析

从表3可以看出，模型=0.0015＜0.01，表明该模型极显著，失拟=0.0899＞0.05，表明差异不显著，R=0.9414表明模型相关度好。从值的分析结果可以看出，各因素对菌数影响的大小顺序为：无机氮源（=29.53）、无机盐（=3.50）和碳源（=0.44）。响应面是响应值对试验因子所构成三维空间曲面图，从响应面分析图上能清楚看出最佳条件及各参数之间的交互作用，响应面图形越陡峭，即其交互作用越明显，图形平稳则说明交互作用比较微弱[15,16]。由图4、5和6可知，碳源（玉米粉）和无机氮源（氯化铵）交互作用最强，碳源（玉米粉）和无机盐（磷酸二氢钾）交互作用最弱。

对试验数据进行回归拟合，可得到生物量和各因子（123）之间的回归方程：=2.16-0.0141-0.112-0.0393+0.01212-0.02013-2.50E-00323-0.06412-0.2022-0.1232根据模型预测得出，当玉米粉浓度为18.87 g·L-1，无机氮源浓度为1.36 g·L-1，无机盐浓度为0.47 g·L-1，发酵培养基中解淀粉芽孢杆菌菌数获得最大值，达到2.18158×109cfu·mL-1。对发酵培养基预测值进行验证试验，取平均值测得解淀粉芽孢杆菌菌数2.20×109cfu·mL-1。预测值与实测值结果基本相同，表明回归方程能够比较真实的反应各因素对菌数的影响。

图4 碳源（玉米粉）和无机氮源（氯化铵）的响应面和等值线

图5 碳源（玉米粉）和无机盐（磷酸二氢钾）的响应面和等值线

图6 无机氮源（氯化铵）和无机盐（磷酸二氢钾）的响应面和等值线

3 结论与讨论

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其生长的过程中产生的一系列的代谢产物，使得解淀粉芽孢杆菌具有较强的抑制真菌和细菌活性的能力，从而减轻真菌和细菌对作物造成的病害[17]。解淀粉芽孢杆菌的菌数主要受培养基成分、发酵培养条件以及复杂的代谢调理机制的影响。解淀粉芽孢杆菌DSYZ液体发酵培养基的优化涉及到多个因素和水平，若是采用传统的正交试验会造成繁重的工作量并且很难得到理想的结果。采用响应面分析法可以迅速、有效的从影响解淀粉芽孢杆菌菌数的因子中筛选出主要影响因素，并且实现条件优化，该统计学方法已经广泛应用于各类发酵培养基的优化[18-22]。在单因素试验中，玉米粉作为碳源时菌数优于其他对照，可能原因是玉米粉属于复合碳源，除了含有主要成分玉米淀粉外，还含有微生物生长所需要的部分氮源以及其他生长因子，能够更大程度地满足微生物生长的条件[23]。除此之外，玉米粉还具有价格低廉、原料易得等优点，为下一步的大规模生产提供了成本上的便利。NH4Cl作为无机氮源时效果最好，可能原因是NH4Cl成分稳定，在发酵培养基中更易被微生物快速利用，而KH2PO4作为无机盐来源时对菌数影响较大，是CaSO4组的121.32%。

通过响应面分析得到解淀粉芽孢杆菌DSYZ最优液体发酵培养基配方为玉米粉浓度18.87 g·L-1，无机氮源浓度1.36 g·L-1，无机盐浓度0.47 g·L-1。对响应面分析结果进行验证试验，取平均数后得到解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌数为2.20×109cfu·mL-1，与预测值2.18158×109cfu·mL-1之间误差小于1%，说明预测模型可靠度高。解淀粉芽孢杆菌DSYZ菌株的发酵培养基优化以及菌数的提高，为其下一步的实验室培养、工业化生产以及农业生产应用提供理论依据。

[1] 张友昌,张教海,王孝纲,等.生物有机肥防止棉花枯萎病和黄萎病的效果[J].棉花科学,2013,35(6):43-46

[2] 李晴晴,徐松,赵维,等.根际微生物组介导的解淀粉芽孢杆菌FH-1对水稻的促生机制[J].微生物学报,2019(10):5-6

[3] Wu L,Wu HJ, Qiao J,. Novel routes for improving biocontrol activity of Bacillus based bioinoculants [J]. Front Microbiol, 2015(6):1395

[4] 王翠娟,王英姿,储昭辉,等.内生型解淀粉芽孢杆菌YTB1407对甘薯根系的促生作用及其调控机理[J].应用生态学 报,2018,29(11):3819-3828

[5] Gowtham HG, Murali M, Singh SB,Plant growth promoting rhizobacteria-Bacillus amyloliquefaciens improves plant growth and induces resistance in chilli against anthracnose disease [J]. Biological Control, 2018,126:209-217

[6] 徐雅雅,张建霞,朱晓丽,等.一株路德维希肠杆菌处理含镉废水的效应分析[J].化学工程,2015,43(6):1-5

[7] 刘波,唐洁,陈廷廷,等.一株路德维希肠杆菌的筛选及其对3-苯氧基苯甲酸的降解特性分析[J].微生物学报,2018,58(5):830-841

[8] 张宝俊,张家榕,韩巨才,等.内生解淀粉芽孢杆菌 LP-5 抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报,2010,37(2):143-147

[9] 王晓辉,王贵鹏,张庆芳,等.一株抗灰霉病解淀粉芽孢杆菌的筛选鉴定及抑菌蛋白的分离[J].吉林农业科学,2015,40(1):64-67

[10] 桑建伟,杨扬,陈奕鹏,等.内生解淀粉芽孢杆菌BEB17脂肽类及聚酮类化合物的抑菌活性分析[J].植物病理学 报,2018(3):402-412

[11] Koumoutsi A, Chen XH, Henne A,. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in strain FZB42 [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2013,29(12):177-184

[12] Chen XH, Scholz R, Borriss M,. Difficidin and bacilysin produced by plant-associatedare efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of biotechnology, 2009,140(1-2):28-44

[13] 向亚萍,周华飞,刘永锋,等.解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用[J]. 中国农业科学,2016,49(15):2935-2944

[14] Deleu M, Lorent J, Lins L,. Effects of surfactin on membrane models displaying lipid phase separation [J]. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 2013,1828(2):801-815

[15] 吴映捷,吕新美,闫兵兵,等.响应面法优化酶辅助提取废弃烟叶中烟碱[J].山东农业大学学报(自然科学版),2017,48(2):203-209

[16] 郝学财,余晓斌,刘志钰,等.响应面法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发,2006,27(1):38-41

[17] 卢彩鸽,董红平,张殿朋,等.解淀粉芽孢杆菌MH1摇瓶发酵培养基及其发酵条件优化[J].中国生物防治学报,2015,31(3):369-377

[18] 刘志祥,曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺,2009(2):127-129

[19] 孙巍,许玫英,孙国萍.毛云芝菌利用糖蜜酒精废水产漆酶培养基优化[J].微生物学通报,2011,38(4):516-522

[20] Gao HJ, Chu X, Wang YW,Media Optimization for Laccase Production byZF-2 Using Response Surface Methodology [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013,23(12):1757-1764

[21] 刘文华,蔡宇杰,范晶晶,等.毛栓菌产漆酶条件优化及该酶对合成染料脱色的特性[J].微生物学通报,2013,40(5):727-738

[22] Liu LH, Lin ZW, Zheng T,Fermentation optimization and characterization of the laccase fromstrain 10969 [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009,44(7):426-433

[23] 宋克丹,李志建,韩坤宸,等.不同粒度玉米粉制作酵子的特性研究[J].食品科技,2019,44(8):185-189

Optimal Fermentation Conditions forDSYZ Based on Response Surface Methodology

XIA Bang-hua1, ZHAO Jian2, GONG Ping1, HAN Xiao-bin2, PENG Yu-long2, LIU Kai1, WANG Cheng-qiang1, DING Yan-qin1, DU Bing-hai1*

1.271018,2.563000,

(DSYZ) is an important Biocontrol Strain and its metabolites have an antagonistic effect on various of pathogenic bacteria, widely used in the biological control of crops, like garlic, pepper, peanut and so on. However, its metabolites have a low concentration under the natural conditions and the concentration is mainly related to the composition of the culture medium, culture conditions, and self-inducing peptide. Therefore, the main objective is to optimize the fermentation medium and increase the number of active strains by response surface analysis. Firstly, fermenting the strain by the soybean sprout juice medium which was added with different carbon, nitrogen and inorganic salts , then determining the number of bacteria to select the exact concentrations of carbon, nitrogen and inorganic salts. Furthermore, the effect of different concentrations of carbon, nitrogen and inorganic salts on the bacteria population was investigated by single factor experiment. After that, response surface analysis was used to optimize the strain fermentation medium , along with the optimal medium combination. Finally, the best carbon source of the optimized fermentation medium was corn meal (18.87 g·L-1), the exact inorganic nitrogen source was ammonium chloride (1.36 g·L-1), the optimal inorganic salt was potassium dihydrogen phosphate (0.47 g·L-1), and the number of bacteria in the optimized medium reached 2.20×109cfu·mL-1, 1.53 times of that before optimization.

; response surface analysis; fermentation medium; medium optimization

S154.39

A

1000-2324(2021)02-0241-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.014

2019-11-04

2020-02-24

国家重点研发计划项目(2017YSD0200804);贵州烟草遵义市烟草公司科技项目(遵烟计[2017]号)

夏邦华(1994-),男,在读硕士研究生,研究方向:农业微生物工程. E-mail:1037352095@qq.com

Author for correspondence. E-mail:du_binghai@163.com