芍药八味汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜保护作用的机制研究❋

王 浩，方 芳，王杰鹏，刘惠聪，苏小霞，李 宓，甄晓静，胡薇薇，方朝义△

(1.河北中医学院附属医院，石家庄 050011； 2.河北省中西医结合肺病研究重点实验室，石家庄 050091； 3. 河北中医学院，石家庄 050200； 4. 石家庄市中医院，石家庄 050051)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮遭受反复损害导致胃黏膜腺体萎缩变薄、胃肌层变厚且伴或不伴肠腺化生和(或)假幽门腺化生的一种慢性胃部疾病[1-3]。在我国，CAG发病率居胃病发病之首并呈年轻化趋势，世界卫生组织更将其列为胃癌发展的癌前状态[4]。现代医学尚未完全阐明CAG的发病机制，多认为其系多种因素综合作用的结果。中医学采用综合疗法治疗CAG取得了显著的临床疗效[5]。芍药八味汤是临床治疗胃脘痛的经验方[6]。前期研究结果显示，该方药可改善大鼠胃肠动力和消化机能[7]。本研究拟通过观察该方药对CAG大鼠血清及胃组织中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和促生长素(growth hormone，GH)的影响，进一步揭示其对胃黏膜产生保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级110只健康Wistar大鼠，6周龄，体质量180～220 g，雌雄各半，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证号1003122。饲养于标准动物房温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，光照黑暗各12 h。

1.2 主要药物

芍药八味汤组成：白芍30 g，广木香9 g，砂仁6 g，陈皮10 g，枳壳15 g，厚朴12 g，郁金12 g，炙甘草6 g，购自石家庄乐仁堂药店。经河北中医学院中药药理学实验室鉴定为合格药材，并由该实验室煎煮浓缩：饮片加水浸泡30 min，先以武火煮至沸腾，后调至文火，每副药物煎煮2次，将所得煎液混合，分别浓缩为含有生药量1.042 g/mL(相当于临床成人用药量的7倍)、2.084 g/mL(相当于临床成人用药量的14倍)的水煎剂，4 ℃冰箱存用。维霉素片(批号20091221，规格0.2 g/片)，郑州复升药业有限公司。

1.3 主要试剂

氨水(批号20080714，含氨气25.0%～28.0%)，沈阳新兴试剂厂；脱氧胆酸钠(批号090511)，美国Sigma公司；PCNA、GH、EGF和VEGF酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、PCNA、VEGF兔抗大鼠多克隆抗体、链霉素-辣根过氧化物酶-生物素(streptaridin-peroxidase，SP)超敏试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色液，石家庄勃盛化学试剂有限公司。

1.4 主要仪器

1-15 K型高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；BX60型光学显微镜(日本Olympus公司)；CM1900型组织切片机(德国LEICA公司)；HI1210型摊片机(德国LEICA公司)；Max M5型酶标仪(美国Molecular Devices spectra公司)。

1.5 分组、模型制备及给药

大鼠适应性饲养1周后随机分为空白对照组(20只)和CAG造模组(90只)，采用复合造模法复制CAG大鼠模型[8]。自造模首日始，每单日自由饮用脱氧胆酸钠(以蒸馏水配成20 mmol/L的溶液，pH 7.0～7.8)，每双日自由饮用0.1%氨水，同时配合饥饱失常法(2 d足食，1 d禁食)，连续造模90 d。

90 d后随机抽取6只造模组大鼠，取胃组织行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，光镜观察胃组织病理形态改变。确认造模成功后，将80只(造模期间4只大鼠死亡，另6只大鼠行HE染色确认模型复制成功)造模大鼠再随机分为模型组、芍药八味汤高、低剂量组和维酶素组每组各20只。

模型复制成功后第2天始灌胃每日1次，连续灌胃30 d。空白对照组和模型组灌服生理盐水(10 mL/kg)，芍药八味汤高、低剂量组分别灌服高、低浓度芍药八味汤煎液(10 mL/kg)，维霉素组灌服维霉素混悬液(0.96 g/kg，相当于临床成人用药量的14倍)。

1.6 取材

大鼠末次给药后禁食不禁水24 h。乙醚麻醉后摘取双侧眼球取血3 mL，静置2 h后离心3500 r/min，15 min，提取血清-20 ℃冻存待检。继以颈椎脱臼法处死大鼠取全胃，剪取胃小弯侧近幽门部大小约0.3 cm×0.5 cm的组织块，置于10%甲醛溶液固定；另称取湿重0.2 g的胃组织置于EP管中，加入1 mL生理盐水，电动匀浆器匀浆，离心4℃6000 r/min，5 min，提取上清液-20 ℃冻存待检。

1.7 检测指标

1.7.1 大鼠一般生物学表征观察 观察大鼠活动、精神状态、毛发光泽度及二便等情况。

1.7.2 HE染色 取固定的胃组织行HE染色，镜下观察大鼠胃组织病理形态改变。

1.7.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PCNA、GH、EGF、VEGF含量 依据试剂盒操作说明书检测PCNA、GH、EGF、VEGF含量。

1.7.4 免疫组织化学染色观察胃组织中PCNA、VEGF蛋白表达 免疫组织化学染色(SP法)观察胃组织中PCNA、VEGF蛋白表达情况。以软件Image-Pro Plus 6.0测量大鼠胃组织积分光密度(integrated optical density，IOD)和阳性表达面积(area)，计算平均光密度(IOD/area)。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般生物学表征观察结果

空白对照组大鼠被毛贴身紧密，光泽明润，目珠转动灵活，活动量大，动作敏捷，大便呈椭圆形颗粒状，耳色及尾尖淡红。模型组大鼠逐渐出现精神萎靡，活动缓慢，反应迟钝，喜扎堆，拱背，便溏，耳及四肢爪甲色淡白，皮毛色泽枯槁易脱落，严重者惊动时神情呆钝，抓取时挣扎少力，大便干稀不调。各治疗组用药后上述表现逐渐好转，尤以芍药八味汤高剂量组改善明显。

2.2 大鼠胃黏膜组织病理形态学观察

2.2.1 肉眼观察 空白对照组胃黏膜呈淡红色，黏膜皱襞表面光滑规整，伸展性好有光泽，表面覆有少量黏液。模型组胃黏膜粗糙，色泽灰暗，可见点状或片状出血，表面黏液减少，皱襞低平、稀少甚至消失，走向紊乱。

2.2.2 光学显微镜观察 图1示，空白对照组大鼠胃黏膜上皮完整，细胞排列整齐且形态规则，呈单层柱状；固有层内呈现大小形状较为一致且密集排列的腺体，腺上皮和腺管分界清楚，细胞呈柱状或圆锥状，胞浆透明或呈小空泡状，偶见散在的淋巴细胞，肌层均匀无增生。模型组大鼠胃黏膜上皮细胞萎缩变薄、变性、坏死、脱落，固有层腺体排列紊乱、疏松，腺体和腺细胞数目减少，体积变小，可见淋巴细胞及浆细胞浸润，部分有淋巴滤泡形成，可见肠上皮化生。治疗组炎症程度均较模型组减轻，胃黏膜炎症以轻中度为主，未见重度炎症，尤以芍药八味汤高剂量组改善明显。

2.2.3 ELISA检测大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量结果 表1示，与空白对照组比较，模型组大鼠EGF、VEGF含量升高，GH含量下降，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，各用药组大鼠EGF、VEGF含量下降，GH含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与维酶素组比较，芍药八味汤高剂量组大鼠EGF水平下降，差异有统计学意义(P<0.01)；芍药八味汤高、低剂量组GH水平均有明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠血清中EGF、VEGF、GH含量比较

2.3 ELISA检测大鼠胃组织PCNA含量结果

表2示，与空白对照组比较，模型组大鼠PCNA含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各用药组大鼠PCNA含量下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 免疫组织化学染色检测大鼠胃组织PCNA、VEGF蛋白表达结果

图2、3表2示，与空白对照组比较，模型组PCNA与VEGF表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，用药组PCNA与VEGF表达均明显降低(P<0.01)。与维酶素组比较，芍药八味汤低剂量组PCNA、VEGF平均光密度明显升高(P<0.01)。

表2 各组大鼠胃组织中PCNA与VEGF水平比较

3 讨论

胃黏膜损伤和固有腺体萎缩是CAG典型的病理改变[9]，临床主要表现为上腹部隐痛、胀满、嗳气、食欲不振等[10]。该病的发病机制尚未完全明确且缺乏理想药物。CAG是在多种因素共同作用下的结果，学者多采用更符合疾病临床特点的多因素综合造模方法建立动物模型，以探究CAG的发生发展规律[11]。本实验采用自由饮用脱氧胆酸钠和氨水，配合饥饱失常法复制CAG大鼠模型，其中自由饮用氨水系模拟幽门螺杆菌感染后高氨状态对胃黏膜的毒性损害，饥饱失常法是模拟人体饮食不节损伤脾胃。结果显示，模型组大鼠胃组织萎缩变薄，腺体体积变小，淋巴细胞及浆细胞浸润，伴见肠上皮化生，证实本实验采用复合因素造模方式成功复制CAG大鼠模型。

PCNA具有参与细胞调控、DNA损伤修复与甲基化、染色体重塑等重要生物学功能[12]，是反映细胞增殖的重要指标，与DNA复制密切相关。VEGF被认为是参与微血管新生的重要因子。研究证实，CAG患者血清中VEGF水平较正常人群明显升高，且被认为与胃癌癌前病变密切相关[13]。EGF是一种对多种组织细胞有强烈促分裂作用的生长因子，可刺激胃黏膜上皮细胞生长，同时能通过抑制胃酸分泌、增强胃黏膜黏液的分泌和增加胃黏膜血流量等机制对胃黏膜起到保护作用[14]，其过度表达可引起组织细胞异常增生、代谢增强，被认为是引起癌变的重要因子[15]。GH是一种具有生长调节功能的单肽链蛋白质激素，对胃黏膜上皮细胞代谢、生长和分化有直接调节作用。本实验研究结果表明，CAG大鼠胃组织PCNA含量升高，血清VEGF和EGF含量增加，提示大鼠胃黏膜受到损伤，胃黏膜细胞过度增殖，DNA复制受损；血清GH水平上高，意味着胃黏膜上皮细胞代谢、生长和分化受到损伤。可见，CAG大鼠在实验过程中存在明显的胃黏膜受损、修复/损伤机制失调。

结合文献以及课题组临床诊治CAG经验，我们认为CAG的发生主要责之于肝气郁结与素体脾胃亏虚，病位主要在肝和脾胃。肝气郁结，横犯脾胃，遂致升降失常；气机郁滞、血行不畅又致瘀血内停。素体脾胃既虚，运化失司，湿聚难化，内生湿热。验方芍药八味汤重用白芍为君，养血柔肝，缓中止痛。现代药理研究证实，白芍具有抗炎、镇痛、保护胃黏膜等作用[16-17]；木香、砂仁、陈皮、枳壳、厚朴行中焦气滞，散中焦湿蕴，其中木香可抗幽门螺杆菌、促进胃动力和抗胃溃疡、保护胃黏膜等[18-19]；郁金活血止痛、行气解郁；炙甘草调和诸药、和中补虚。诸药合用契合CAG之病机。本研究结果提示，芍药八味汤后可下调PCNA、VEGF、EGF表达，上调GH含量，说明芍药八味汤可调节细胞增殖和生长代谢，抑制微血管再生，促使CAG大鼠胃黏膜修复与损伤之间协调与平衡，从而保护胃黏膜。