超高效液相色谱-串联质谱法快速筛查中成药中49种违法添加化学药物

许晓辉，杨志敏，吴兴强，吴福祥，张 文，冯 翀，王小乔*

(1.兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州 730050;2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

中成药是以中医药理论为指导，以中药材为原料，按规定的处方和方法加工成具有一定剂型的药物。近年来,药品流通市场上存在打着天然中药制剂的旗号，却在中成药中违法添加化学药物以增强疗效的现象[1-2]。由于中成药的化学成分复杂，使得在其中违法添加化学药物具有隐蔽性，不易被发现，若被患者长期服用会造成不可逆转的健康损害，导致一系列不良反应，甚至危及生命安全。开展中成药中违法添加化学药物的监控对于保证中成药的安全使用具有重要意义。

目前，采用液相色谱-质谱联用技术监测中成药中违法添加化学药物的应用研究日渐增多，能够监控的药物类别也在增多[3-12]。国家药品监管部门历来严厉打击中成药中违法添加化学药物，颁布了相关检测标准与检验方法，如止咳平喘类(批准件编号2009031)、抗风湿类(批准件编号2009025)、降糖类(批准件编号2009029)、安神类(批准件编号2009024)、补肾壮阳类(批准件编号2009030)、降压类(批准件编号2009032)等[13]。这些标准与检验方法大部分采用液相色谱和液相色谱-质谱联用方法，对于复杂样品中痕量组分的检测常用三重四极杆质谱(QQQ)及多反应监测模式(MRM)，QQQ的MRM模式具有较高的灵敏度和选择性。从监控现状来看，违法添加化学药物一般是多类别多组分同时添加，化合物数目达到几十种甚至上百种，因此通常要求一针进样实现多类别多组分化合物的监测，此时选用MRM会受循环时间限和离子驻留时间限的影响，导致检测灵敏度和选择性下降。动态多反应监测模式(d-MRM)[14-15]消除了以上限制，当组分离子从液相色谱洗脱时，d-MRM只监测组分离子，可根据保留时间自动分配采集时间和采集点数，能够获得所需的循环时间，保证每个峰均能获得足够的数据点和定量分析的准确度，对于共流出峰能最大限度利用离子驻留时间，在保持恒定循环时间的同时可增强分析物的信噪比，以显著改善样品负载循环时间，提高监测化合物的灵敏度和选择性。

本文运用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的d-MRM模式建立了中成药中违法添加化学药物的测定方法，根据化合物的质谱响应、峰形以及加标回收率，最终筛选出8类49种目标药物，包括止咳平喘类、抗风湿类、 降压类、降糖类、 减肥类、辅助降血脂类、补肾壮阳类、镇静安神类。该方法前处理简单，一针进样可在15 min内实现49种药物的同时测定，能够为中成药中违法添加化学药物的监测提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

1290-6460超高效液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾离子源(美国安捷伦有限公司)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多公司)；真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)；移液器(20 μL、100 μL、1 mL)、5810R离心机(德国Eppendorf公司)；Vortex-genie 2涡旋混合器(美国Scientific公司)；SBL-10DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸、乙酸铵(色谱纯，东京化成工业株式会社)。

对照品：除伐地那非二盐酸盐购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，羟基豪莫西地那非、他达拉非、利血平购自北京曼哈格生物科技有限公司外；其他标准品均购自中国食品药品检定研究院，纯度≥98.3%。供试样品来源于涉案委托检验样品、网购样品、委托检验样品等，样品剂型为胶囊、片剂和颗粒剂。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～2.0 min，10%B；2.0～3.0 min，10%～35%B；3.0～4.0 min，35%B；4.0～5.0 min，35%～40%B；5.0～6.0 min，40%B；6.0～12.0 min，40%～85%B；12.0～14.0 min，85%B；14.0～14.1 min，85%～10%B；14.1～15.0 min，10%B。

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，d-MRM扫描模式，雾化气为N2，干燥气流速为8 L/min，喷雾电压为500 V，气流温度为325 ℃，毛细管电压为4 000 V，鞘气流速为12 L/min，鞘气温度为350 ℃；其他质谱条件见表1。

表1 49种药物的主要质谱参数Table 1 The main mass spectral parameters of 49 drugs

*quantitative ions

1.3 溶液制备

1.3.1 对照溶液49种药物标准储备溶液：精密称取10.0 mg各对照品，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度均为1 mg/mL的储备液，于4 ℃冷藏备用。混合标准中间溶液：分别准确吸取上述标准储备溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成1 μg/mL的混合标准中间溶液，于4 ℃冷藏备用。混合标准使用溶液：精密移取上述混合标准中间溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，即得。

1.3.2 供试品溶液精密称取样品1 g，置于50 mL离心管中，精密加入10.00 mL乙腈，涡旋1 min，在300 W功率下超声提取30 min，放冷至室温，5 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液作为待测液。

1.3.3 阴性样品溶液取未检出49种药物的样品，按照“1.3.2”步骤制成阴性样品溶液，即空白基质样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

本文的49种目标药物大部分在甲醇和乙腈中具有良好的溶解性，因此对比了分别以甲醇和乙腈为提取溶剂时的提取效果。结果表明，两个提取溶剂的回收率均在85.0%以上。考虑到乙腈毒性小、价格低，因此选择以乙腈为提取溶剂，并采用超声辅助提取，提取溶液经离心后取上清液，过0.22 μm微孔滤膜。优化的前处理条件如“1.3.2”所示。

2.2 色谱条件的优化

由于49种药物的极性相差较大，因此选择适于极性化合物分离的C18色谱柱。在流动相的选择上，由于甲酸可提高药物在ESI+模式下的离子化效率，乙酸铵可稳定水相和改善峰形，因此考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈以及0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液3种流动相的分离效果。实验发现，以0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相时，大部分目标药物的分离效果、检测时间及灵敏度均较优，故本方法选其作为流动相。优化的色谱条件如“1.2”所示。

2.3 质谱条件的优化

由于目标药物种类多，采用MRM采集模式时受循环时间限的影响，导致有些药物的响应低。因此，将待测药物分别配制成单个标准溶液，利用MassHunter采集软件，以手动和自动两种方式同时优化定性和定量离子、碰撞能量、裂解电压等参数，建立MRM方法。为了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合标准使用溶液，将所采集数据文件从MassHunter质谱采集工作站软件导入自动生成d-MRM方法，包含化合物名称、MRM离子对、碎裂电压、碰撞能量、动态MRM的保留时间和保留时间增量窗口，对于软件不能自动识别保留时间及保留时间增量窗口的化合物，在安捷伦定性软件通过提取化合物的离子对手动识别。优化的质谱条件如“1.2”所示。

图1 49种药物的MRM总离子流图(50 ng/mL)Fig.1 MRM of total ion chromatogram of 49 drugs(50 ng/mL)

以d-MRM 模式测定49种药物的定性和定量离子对色谱图，共有98个离子监测通道。图1为49种药物混合标准溶液(50 ng/mL)的总离子流图，各化合物峰形对称，每个检测通道无干扰，定量准确可靠。

2.4 专属性考察

取“1.3.3”阴性样品溶液 2 μL，按“1.2”条件进样并采集谱图，得到阴性样品溶液的 MRM 色谱图(图略)，均无干扰49种化学药物的色谱峰。结果表明，样品基质不干扰目标物的测定，方法专属性好。

2.5 线性关系与检出限

用空白基质样品溶液稀释混合标准使用溶液，得到质量浓度分别为0、2、5、10、20、30、40、50、60 ng/mL的标准曲线溶液，采用本方法进行测定。以待测药物的质量浓度为横坐标(x，ng/mL)，对应组分的定量离子对峰面积为纵坐标(y)，得到各药物的线性回归方程。将混合标准使用溶液加入空白基质中，加标浓度逐级递减至1.0 ng/mL，按“1.3.2”方法处理后上机检测，以3 倍信噪比计算各药物的检出限(LOD)。结果显示，49种药物在0～60 ng/mL范围内线性关系良好，r2为0.993 2～0.999 5，检出限为0.290～2.546 ng/g(见表2)。

表2 49种药物的线性关系、检出限、回收率与相对标准偏差Table 2 Linear relationships,limits of detection,recoveries and RSDs of 49 drugs

图2 西地那非(A)与他达拉非(B) 阳性样品的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of positive samples for sildenafil(A) and tadalafil(B)

2.6 回收率与相对标准偏差

在阴性样品中分别按15.0、35.0、70.0 ng/g 3个浓度添加混合标准中间溶液，平行制备3份样品，按“1.3.2”方法进行处理后上机检测，每份样品重复测定3次。结果显示，49种药物的平均回收率为86.4%～107%，相对标准偏差(RSD)为0.80%～3.5%(见表2)。

2.7 实际样品测定

采用本方法测定收集的20批样品，发现阳性样品5批，检出的药物为二甲双胍、苯乙双胍、格列苯脲、西地那非、他达拉非和西布曲明，检出量分别为0.076 97、1.153、0.013 41、69 500、2 400、724.0 mg/kg。西地那非与他达拉非阳性样品的总离子流色谱图见图2。

3 结 论

本研究通过优化前处理方法、色谱条件和质谱条件，采用动态多反应监测模式，建立了一种同时测定多类别违法添加化学药物的UPLC-MS/MS检测方法，并进行了方法学考察。运用建立的方法测定20批实际样品，检出了二甲双胍、苯乙双胍、格列苯脲、西地那非、他达拉非和西布曲明。该方法前处理简单，灵敏度高，准确度好，专属性强，适用于中成药中违法添加化学药物的检测。