多指标综合加权评分法优化清胃散提取工艺研究

刘欢欢，张倩，徐婷婷，王颖卓，王珏，赵林钢，姚毅，张先林，刘史佳

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

经典名方清胃散源于金代李东垣的《兰室秘藏》和《脾胃论》，是临床常用清热剂，主治胃火牙痛之证。《兰室秘藏》中描述该方由当归身、细黄连、生地黄各三分，牡丹皮五分，升麻一钱组成，煎煮时均为细末，都做一服，水一盏半，煎至一盏，去滓，带冷服之[1]。

清胃散收录在2018年国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中，并在临床上应用广泛。由于流传甚久，该方的临床应用剂量已发生显著变化[2]。目前关于清胃散的研究多见于文献考证及临床应用，仅有一篇HPLC特征图谱方法及部分煎煮工艺影响因素的研究报道[3]。

本研究拟以清胃散的HPLC特征图谱相似度、出膏率和主要成分阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的含量为指标，在单因素预试验的基础上，设计正交实验考察煎煮水量、煎煮时间和煎煮次数等影响因素[4]，运用AHP结合CRITIC法赋值多指标权重，综合加权评分，确定清胃散汤剂的煎煮方法，为后续开展清胃散标准汤剂的物质基础和药效研究提供基础。

1 材料

1.1 实验材料

盐酸小檗碱(批号：Y31J9H67024)、丹皮酚(批号：D1619066)、阿魏酸(批号：H27J7L16718)、异阿魏酸(批号：A11M9L61182)均购自上海源叶生物科技有限公司；毛蕊花糖苷(批号：lw19010908)均购自南京良纬生物科技有限公司，纯度均≥98%；甲醇为色谱纯(德国Merck公司)，水为纯净水；其他试剂均为分析纯。药材牡丹皮(批号:200201，产地安徽铜陵)、黄连(批号:190501-01，产地重庆)、地黄(批号:19102511，产地河南焦作)、升麻(批号:20190201，产地辽宁)、当归(批号:20020905，产地甘肃定西)，经南京中医药大学附属医院张倩副主任中药师鉴定为毛茛科牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，毛茛科黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎，玄参科地黄的RehmanniaglutinosaLibosch.干燥块根，毛茛科大三叶升麻CimicifugaheracleifoliaKom.的干燥根茎和伞形科当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根。

1.2 实验仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪(配G1322A脱气机、G1312B二元泵、G1367E自动进样仪、G1316D柱温箱、G4212B二极管阵列检测器)；AX224ZH/E型电子天平(常州奥豪斯仪器有限公司)；KQ-1000型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海一恒仪器有限公司)；HH-601超级电热恒温水浴箱(江苏金坛环宇科学仪器厂)；80-2型台式低速离心机(常州国华电器有限公司)；Eppendorf 5430R高速冷冻离心机(德国)。

2 方法

2.1 清胃散特征图谱及含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)，磷酸二氢铵缓冲液(pH=3)(B)，梯度洗脱如下：0～15 min，1%A；15～20 min，1%～10%A；20～40 min，10%A；40～45 min，10%～15%A；45～60 min，15%～22%A；60～70 min，22%A；70～80 min，22%～30%A；80～100 min，30%～40%A；100～110 min，40%～50%A；110～115 min，50%～70%A；115～125 min，70%A；125～130 min，70%～1%A；130～140 min，1%A；流速1 mL/min；检测波长230 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 按处方量[1]分别称取升麻、黄连、牡丹皮、当归和地黄粗粉，进行加热回流，水浴蒸干，60 ℃真空干燥箱干燥至恒质量得浸膏样品。分别称取浸膏0.05 g，加入1 mL纯水溶解，超声15 min，4 000 r/min离心3 min，移取上清，混匀后过0.45 μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚对照品适量，用甲醇溶解后定容，得对照品母液。精密移取各对照品母液一定量，混合定容至同一容量瓶内，配置成已知浓度的混合对照品溶液阿魏酸428.57 μg/mL，异阿魏酸714.29 μg/mL，毛蕊花糖苷3 571.43 μg/mL，盐酸小檗碱714.29 μg/mL，丹皮酚71.43 μg/mL。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 分别称定缺黄连、缺升麻、缺牡丹皮、缺当归和缺地黄的处方量药材，按“2.1.2”下方法制备缺黄连、缺升麻、缺牡丹皮、缺当归和缺地黄的5份阴性样品溶液，置于4 ℃保存。

2.1.5 线性关系考察 依次精密吸取上述“2.1.3”项下混合对照品溶液适量，用30%甲醇稀释后，混合均匀，倍比稀释后得系列质量浓度的混合对照品溶液。精密吸取10 μL按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围。

2.1.6 精密度 精密吸取“2.1.2”下制备的供试品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，以峰面积计算相对标准偏差(RSD)。

2.1.7 重复性 按照“2.1.2”下平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样进行测定，记录峰面积，计算质量分数与RSD。

2.1.8 稳定性 取同一供试品溶液6份，在室温下(25 ℃)自然放置，分别于0、6、12、24、36 h精密吸取10 μL按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测定各成分峰面积；再取同一供试品溶液6份于4 ℃下分别测定第0、3、5、7 d的各成分峰面积，记录峰面积计算RSD。

2.1.9 加样回收率试验 分别精密吸取已测定的供试品溶液6份，每份100 μL，分别精密添加相当于已知含阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的混合对照品适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析测定峰面积并计算各成分加样平均回收率和RSD。

2.2 特征图谱分析

将“2.1.2”所述制备的供试品溶液按照“2.1.1”的色谱条件下进行色谱分析，记录色谱图。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)》软件进行分析。对前5 min和后20 min图谱进行剪切，以S1样品图谱为参照图谱，时间窗宽度设置为0.4，采用多点校正方法匹配色谱图，通过中位数法生成对照图谱，计算相似度。

2.3 样品含量测定

精密称取正交试验样品，按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，进样测定。根据线性回归方程，计算样品中阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的含量百分数。

2.4 出膏率

称取处方量药材9份，药材质量记为M1，按正交设计表所列条件进行加热回流，水浴蒸干后，常压80 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，精密称定质量，得到供试品干膏，质量记为M2，根据公式(1)计算得出膏率。

公式(1)

2.5 提取正交试验设计

选定料液比(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为考察因素，以HPLC指纹图谱相似度、出膏率和阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的含量为评价指标，采用四因素三水平的L9(34)表进行正交试验，优选出最佳的提取工艺，采用多指标综合加权评分法对试验结果进行方差分析。

2.6 指标权重确立和综合评分

依据清胃散君臣佐使配伍原则及指标性成分的药理作用，综合层次分析(AHP)法和指标相关性权重(CRITIC)法，计算综合权重。AHP法首先确定优先顺序：HPLC特征图谱>出膏率>盐酸小檗碱>异阿魏酸>丹皮酚>毛蕊花糖苷>阿魏酸，构建判断矩阵，接着按照文献方法赋予评分[5]，然后依据评分结果确定各指标权重系数，并计算一致性比例因子(CR)，确证权重系数有效。

CRITIC法按照文献方法[6]，将表中的数据进行标准化处理后，采用SPSS 22.0软件处理数据得相关系数矩阵，结果显示两两成分呈正相关，设Ci表示第i个指标所包含的信息量，Wi表示第i个指标的权重系数，由公式(2)得到HPLC特征图谱相似度、出膏率、盐酸小檗碱、异阿魏酸、丹皮酚、毛蕊花糖苷和阿魏酸权重系数。

公式(2)

结合两种方法，按照文献公式计算综合权重[5]，得到各指标的权重系数。在此基础上按照公式(3)计算综合评分值(Y)，利用Y对试验结果进行方差分析。Wj表示第j个指标的权重系数，Aij表示第i次试验中第j个指标的测定值，以各指标的最大值作为参照对同一指标各数据进行标准化处理，Bij表示第j个指标下第i个测定值的标准化数据。Bij=Aij/(Aj)max，其中i=1，2，…，9；j=1，2，…7。Y值越大，表示综合评分越高，提取工艺越好。

公式(3)

2.7 验证试验

按照正交试验考察后的工艺条件进行提取，得到3批清胃散供试品溶液，按照2.1～2.4项下计算出膏率、特征图谱相似度和主要成分的含量，计算RSD进行验证。

3 结果

3.1 HPLC特征图谱和方法学实验结果

3.1.1 专属性试验结果 通过比对全方及阴性供试品药的HPLC特征图，对清胃散中各味药的特征峰进行指认。黄连的特征峰为4、5、6、7、13、14号峰，其中第13号峰为盐酸小檗碱；升麻的特征峰为1、2、10、11、15、17号峰，其中第11号峰为异阿魏酸；牡丹皮特征峰为3、8、9、16、18号峰，其中第16号峰为丹皮酚；当归的特征峰为5、10号峰，其中第10号峰为阿魏酸；生地黄的特征峰为12号峰，为毛蕊花糖苷。见图1。

注：A.混合对照品；B.全方；C.当归阴性；D.地黄阴性；E.丹皮阴性；F.黄连阴性;G.升麻阴性；10.阿魏酸；11.异阿魏酸；12.毛蕊花糖苷；13.盐酸小檗碱；16.丹皮酚图1 全方、当归阴性、地黄阴性、升麻阴性、牡丹皮阴性、黄连阴性及各指标性成分专属性HPLC色谱图

3.1.2 线性关系考察结果 以对照品进样质量浓度为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围分别为：阿魏酸Y=32.878X-73.627，r2=0.999 8，0.86～428.57 μg/mL；异阿魏酸Y=36.490X-57.183，r2=0.999 9，1.43～714.29 μg/mL；毛蕊花糖苷Y=5.691X-10.739，r2=0.999 9，35.71～714.29 μg/mL；盐酸小檗碱Y=7.475X-26.199，r2=0.999 6，7.14～714.29 μg/mL；丹皮酚Y=27.954X+9.847，r2=0.999 8，0.71～71.43 μg/mL。表明各成分的线性较好。

3.1.3 精密度试验结果 阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的峰面积RSD值分别为2.25%、0.67%、3.09%、1.51%和1.89%，结果表明仪器精密度良好，符合定量测定要求。

3.1.4 重复性试验结果 记录阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的峰面积，并分别计算质量百分数，RSD分别为3.68%、3.37%、3.24%、2.84%、3.26%，结果表明该方法重复性良好。

3.1.5 稳定性试验结果 25 ℃下阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的峰面积RSD分别为4.93%、1.32%、4.77%、3.35%、4.09%。结果表明供试品溶液在36 h内的稳定性良好。

4 ℃下阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的峰面积RSD分别为1.35%、0.51%、4.72%、3.74%、4.88%。结果表明供试品溶液在4 ℃存放7 d的稳定性良好。

3.1.6 加样回收率试验 阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的峰面积并计算各成分的加样平均回收率为99.55%、98.04%、100.07%、99.90%、99.87%，RSD分别为3.56%、2.69%、3.30%、1.75%、2.67%。

3.2 HPLC特征图谱相似度分析结果

按“2.2”下方法以S1样品图谱为参照图谱，时间窗宽度设置为0.4，采用多点校正方法匹配色谱图，采用对照品比对(图2)，共确定了49个共有峰(见图3)，指认了其中5个共有峰：阿魏酸(29号峰)，异阿魏酸(32号峰)，毛蕊花糖苷(37号峰)，盐酸小檗碱(41号峰)，丹皮酚(44号峰)，9份样品的相似度其中7份大于0.9，其余2份大于0.8，质量相对稳定。

注：1.阿魏酸；2.异阿魏酸；3.毛蕊花糖苷；4.盐酸小檗碱；5.丹皮酚图2 混合对照品HPLC图谱

图3 清胃散水提物指纹图谱

3.3 样品含量测定

按照“2.3”项下方法测得正交试验1～9号供试品溶液的阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚的含量如表1所示。

表1 正交试验供试品溶液的含量测定结果(%)

3.4 出膏率

按照“2.4”下方法测得正交试验1～9号供试品溶液的出膏率分别为20.22%、36.66%、38.00%、43.32%、40.00%、30.60%、37.00%、25.92%、41.65%。

3.5 指标权重确立

依据评分结果(见表2)，按照层次分析法(AHP)确定各指标权重系数分别为0.350、0.197、0.184、0.102、0.069、0.037、0.062。一致性比例因子(CR)=0.096<0.10，具有较好的一致性，权重系数有效。

表2 AHP法各指标的优先判断矩阵

CRITIC法将表中的数据按照公式进行标准化处理后，采用SPSS 22.0软件处理数据得相关系数矩阵，结果显示两两成分呈正相关，由公式得到HPLC特征图谱相似度、出膏率、盐酸小檗碱、异阿魏酸、丹皮酚、毛蕊花糖苷和阿魏酸权重系数分别为0.142、0.129、0.163、0.089、0.174、0.169、0.135。

结合2种方法，按照公式计算综合权重，得到各指标的权重系数HPLC特征图谱相似度(X1)为0.353，出膏率(X2)为0.180，盐酸小檗碱(X3)为0.214，异阿魏酸(X4)为0.064，丹皮酚(X5)为0.085，毛蕊花糖苷(X6)为0.045，阿魏酸(X7)为0.059。

3.6 正交实验结果

根据上述“2.5”项下内容进行正交试验，优选出最佳的提取工艺，结果见表3。由表3直观分析可知，因素C(提取次数)的极差R最大，因此是主要影响因素。各因素对清胃散水提取效果的影响次序依次为提取次数(C)>料液比(A)>提取时间(B)。各因素不同水平程度依次为A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1，结果表明清胃散的最佳水提工艺为A3B3C3。表4方差分析表明3个因素对水提工艺均没有显著性影响(P>0.05)，两因素交互影响如图4所示。考虑到大生产合理、节能降耗的要求，确定最佳提取工艺为A2B2C2，即加12倍量的水，煎煮60 min，提取2次。

图4 正交试验两因素交互影响图

表3 提取工艺正交试验设计与综合评分结果

表4 水提工艺方差分析结果

3.7 验证实验结果

按照确定后的工艺条件提取得到3批供试品验证实验结果，结果出膏率为39.99%，HPLC特征图谱相似度>0.964，主要成分阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的平均含量分别为0.061%、0.535%、0.060%、0.261%、0.054%，RSD分别为0.770%、0.638%、2.568%、2.545%、0.722%。

4 讨论

清胃散由黄连、升麻、牡丹皮、地黄和当归组成，原方在《兰室秘藏》中选“当归身，择细黄连(如连不好，更加二分，夏月倍之)，生地黄(酒制)各三分，牡丹皮五分，升麻一钱”；在《脾胃论》中选“真生地黄、当归身各三分，牡丹皮半钱，黄连拣净六分(如黄连不好，更加二分；如夏月倍之，大抵黄连临时增减无定)，升麻一钱”[7]。方中以黄连为君药，升麻、牡丹皮为臣药。考虑到黄连和升麻均为多来源品种，因此本试验中选用市场用量较大的味连和大三叶升麻进行研究。经方原著中酒地黄和生地黄均可用，现代临床也常见用生地黄[8]，且药典中未收载酒地黄，缺乏确切的炮制和质控方法，同时生地黄具有清热凉血的功效，与清胃散功效更为贴切，故本试验方中选用生地黄开展研究。

结合2020版《中国药典》质量控制要求[9]，本试验中选取阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱及丹皮酚为清胃散质量控制的主要物质基础。其中异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚分别为升麻、地黄、黄连和牡丹皮的专属性指标。梓醇虽然也是生地黄的药效成分，但剂量较小难以测到，且在相同的保留时间有牡丹皮成分的干扰，因此没有选择梓醇作为生地黄的质控指标。而阿魏酸虽然不是专属性成分，但是升麻和当归的主要药效成分，因此也作为清胃散的代表性质量控制成分。另考虑到出膏率和HPLC特征图谱一致性对药材有效成分的提取情况均具有总体代表性[3]。综上所述，本实验选择HPLC特征图谱相似度、出膏率和阿魏酸、异阿魏酸、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的含量作为综合评价指标。

在正交试验设计中，依据《医疗机构中药饮片煎煮规范》规定，一般中药饮片应当先行浸泡，浸泡时间一般不少于30 min，每剂药一般应煎煮2次，将2次药汁混合后再分装。本研究在前期文献研究和单因素实验基础上，以煎煮水量、煎煮时间及煎煮次数为考察因素，采用AHP结合CRITIC法权重赋值多指标权重，采用综合加权评分法，优化清胃散汤剂的煎煮工艺，确定清胃散的煎煮工艺为：取处方量粗粉饮片至锅中，加水288 mL，浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮60 min，煎煮2次，合并滤液并浓缩至200 mL即得。此煎煮工艺符合医疗机构中药饮片的煎煮要求。

本研究确定的清胃散煎煮工艺建立在实验室基础之上，由于实验室条件的局限性，与实际大生产之间尚存在一定差距，包括粉碎粒度、过滤设备等因素尚未考虑。因此若开展清胃散生产提取工艺研究，应进一步进行中试放大及大生产工艺的研究，更高效保留药效物质基础，提高制剂生产质量。