狭小空间法构建抑郁症大鼠模型的优劣探索*

闫雪, 曾德浩, 李超群, 张毅靖, 祝赫, 唐洪梅

1广州中医药大学第一附属医院药学部(广东广州 510405)； 2南方医科大学中医药学院(广东广州 510515)

抑郁症是一种严重的精神疾病，以显著而持久的情绪低落为主要临床特征，给个人、家庭以及社会带来巨大压力和沉重的负担。世界卫生组织(WHO)预测抑郁症将成为危害人类健康的第二大疾病。近年来，国内外众多学者对抑郁症的基础或临床开展研究，使其成为医学研究的热点之一。因此，稳定、易于操作的抑郁症动物模型制备方法是这些研究的基础和关键。2019年，中华中医药学会中药实验药理专业委员会起草并公布了《抑郁症动物模型制备规范(草案)》[1](以下简称“草案”)。该草案基于对现有抑郁症动物模型大量实验研究，总结了6类抑郁模型，其中有药物、手术和慢性不可预知应激刺激结合孤养等多种不同的方式。慢性不可预知应激刺激结合孤养模型是近年来广受关注的一种抑郁症研究模型，其疾病发生和表现形式更符合人类的发病原因，可模拟人类的抑郁症状及一系列抑郁后生物化学改变，已被广泛应用于抑郁症研究领域[2]。但该方法存在耗时较长，劳动量大，结果不稳定，难重复的问题。特别是造模的强度和时间难以掌握，实验组动物如所受刺激过于强烈，动物会对应激产生耐受或者动物变得异常狂躁；如所受刺激过于温和，动物则不易产生抑郁样行为[1]。本研究自2019年7月至2020年4月，模拟抑郁症发病的刺激因素，创新性地尝试一种新的造模方式，亟待能通过容易操作的刺激方式构建耗时短、劳动量小、易控制刺激强度的抑郁症大鼠模型，且有与经典方法相同的造模效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 SPF级SD雄性大鼠30只，体重(250±20)g，购自广州中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCK(粤)2013-0034。水合氯醛(广州中医药大学第一附属医院，20190901)，4%多聚甲醛(上海生工，E672002)、RIPA蛋白裂解液(广州杏海生物，GB20173)、HE染色相关试剂(珠海贝索，EA-50)、冰冻切片机(leica，CM1950)、ELISA试剂盒[5-羟色胺(5-HT)](南京建成，H104)，自制旷场反应箱。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模方法 将大鼠30只常规饲养1周，后随机分为3组，正常对照组、慢性温和不预知应激模型组(CUMS组)和狭小空间模型组(M组)10只。正常对照组大鼠常规饲养。CUMS组采用应激方式如下：禁食24 h/次、禁水24 h/次、鼠笼倾斜30°过夜/次、潮湿饲养过夜/次、4℃冰水游泳5 min/次、昼夜颠倒/次、夹尾1 min/次，采用随机数字表法每天随机予2种应激。造模4周。M组大鼠单独饲养于10 cm×10 cm×5 cm的狭小孤笼中，给予正常饮食，连续造模4周。

1.2.2 体重测定 各组大鼠在0、7、14、21、28 d测量体重。

1.2.3 饮水及摄食量测定 各组大鼠在0、7、14、21、28 d测量饮水及摄食量。测定前于0 h称量并记录水瓶及饲料的重量，24 h内大鼠自由饮水进食，24 h后再次称量并记录水瓶及饲料的重量，计算饮水及饲料的消耗量。

1.2.4 糖水偏好试验 各组大鼠在0、7、14、21、28 d进行1次此试验。试验前禁食、禁水12 h，试验时，首先将各组大鼠孤笼饲养，然后每笼放置2个装有2%蔗糖水的小瓶，12 h后换为每笼2%蔗糖水和饮用水各1瓶，2 h后取走所有小瓶并称重，计算糖水、饮用水和总液体消耗量以及糖水偏爱百分比。

1.2.5 旷场试验 大鼠旷场反应箱100 cm×100 cm×35 cm，内壁涂黑，底面平均分为25个20 cm×20 cm小方格，旷场正上方2 m处架一数码摄像头，其视野覆盖整个旷场。试验时将大鼠放置于清洁敞箱中央，每次录像时间5 min，然后人工计算大鼠直立次数和穿格次数，各组大鼠在0、14、28 d各试验1次。

1.2.6 HE染色检测 用水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛全身灌注，取海马组织使用酒精梯度脱水、石蜡包埋和冰冻切片。将制好的切片脱蜡至水，逐步完成染色、脱水、透明、封固后，进行镜下观察。

1.2.7 ELISA法检测海马组织5-HT含量 海马组织使用RIPA蛋白裂解液匀浆提取蛋白备用，按照ELISA试剂盒提供的实验步骤进行操作检测。

1.3 指标分类及量化评分[1]

1.3.1 表观指标 Ⅰ类指标(核心指标)：动物的体重、偏好、活动性、食欲等是该模型重要的表观指标。模型制备成功后，体重减轻、兴趣索然、活动性显著降低、食欲下降。表观指标在抑郁症模型的评价中占有重要地位，根据表观指标的特点评分，正常得0分，异常得1分。

1.3.2 生化指标 Ⅱ类指标(直接相关指标)：目前，抑郁症的病因并不清楚，发病机制比较复杂，多数学者将其归因于单胺类神经递质假说，其认为5-HT的含量降低是抑郁症的重要生化指标。5-HT含量正常得0分，异常得1分。

1.3.3 病理学指标 Ⅲ类指标(间接相关指标)病理学指标不是临床诊断的内容，主要是模型研究时体现。对脑组织的组织形态的变化是抑郁症模型组织病理变化研究的重点。脑组织的神经元细胞数目正常，形态整齐，包浆丰富，排列规律整齐得0分；神经元细胞数目减少，形态不整齐，包浆固缩，排列无规律、较紊乱得1分。

1.3.4 指标分类及量化评分 将以上指标进行分类，并确定各类权重系数。草案对表观指标中的7项小指标进行了评分，而本研究仅对其中5项进行评分，因此Ⅰ类指标权重系数仅为原草案表观指标评分权重系数的5/7为标准进行评分。见表1。

表1 指标分级

2 结果

2.1 体重变化 0、7 d 3组大鼠的体重差异均无统计学意义(P>0.05)；14 d，CUMS组、M组大鼠的体重与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且CUMS组与M组大鼠的体重差异有统计学意义(P<0.05)；21 d CUMS组、M组大鼠与正常对照组相比体重差异均有统计学意义(P<0.01)；28 d CUMS组、M组大鼠与正常对照组相比体重差异均有统计学意义(P<0.01)；21 d、28 d CUMS组与M组大鼠的体重差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠体重情况

2.2 狭小空间模型大鼠饮水及进食量变化 两组大鼠在0 d的饮水和进食量差异无统计学意义(P>0.05)。但在造模7 d时，M组大鼠的饮水量明显减少，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，CUMS组虽然饮水量减少，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模7 d时，CUMS组、M组与正常对照组比较进食量减少并差异有统计学意义(P<0.01)。14、21、28 d，CUMS组、M组与正常对照组比较饮水量及进食量均减少并差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。见表3～4。

表3 大鼠饮水量情况

2.3 狭小空间模型大鼠糖水偏好度变化 0、7 d 3组大鼠的糖水偏好百分比差异均无统计学意义(P>0.05)；14 d M组大鼠的糖水偏好百分比与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；21、28 d CUMS组、M组大鼠与正常对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)；0、7、14、21、28 d CUMS组与M组大鼠的糖水偏好百分比差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表4 大鼠进食量情况

表5 造模不同时间糖水偏好百分比

2.4 旷场实验 0 d 3组大鼠的直立次数与方格间穿越次数差异均无统计学意义(P>0.05)。7 d CUMS组与正常对照组相比直立次数差异无统计学意义(P>0.05)，方格间穿越次数差异有统计学意义(P<0.05)；M组与正常对照组相比直立次数和方格间穿越次数差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，M组与CUMS组相比直立次数差异无统计学意义(P>0.05)，方格间穿越次数差异有统计学意义(P<0.05)。14、21、28 d，CUMS组、M组大鼠与正常对照组相比，直立次数与方格间穿越次数差异均有统计学意义(P<0.01)。14、21 d, CUMS组与M组大鼠相比直立次数与方格间穿越次数差异均有统计学意义(P<0.01)；28 d, CUMS组与M组大鼠相比直立次数及方格间穿越次数差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。见表6～7。

表6 旷场实验中大鼠直立次数 次

表7 旷场实验中大鼠方格间穿越次数 次

2.5 狭小空间模型大鼠海马组织病理变化 正常对照组大鼠海马组织细胞结构正常，排列整齐，形态完整。CUMS组及M组大鼠海马组织呈现弥散性损伤，神经元细胞数目较少，形态不整齐，包浆固缩，排列无规律、较紊乱。见图1。

注：A：正常对照组；B CUMS组；C：M组

2.6 狭小空间模型大鼠血清中5-HT含量变化 正常对照组、CUMS组和M组的5-HT水平分别是983.21±54.18、353.67±25.33和365.23±23.54。与正常对照组比较，CUMS组及M组大鼠海马组织5-HT水平显著降低(P<0.01)，且CUMS组与M组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.7 模型制备评判标准 CUMS组与M组抑郁症模型得总积分>0.5，提示模型制备成功。见表8。

表8 各组模型的量化评分 分

3 讨论

全世界约有3.5亿人饱受抑郁之苦，中国的抑郁症发病率约为3.02%，据估计真实的数据可能远远高于这个数字[3]。然而，目前人类对于抑郁症的病因和发病机制仍未完全明确。其机制的研究和药物的研发必须首先建立在比较理想的抑郁症动物模型上。目前已经用于构建的抑郁症大鼠模型的大鼠主要有天生对应急敏感的WISTAR KYOTO(WKY)大鼠[4]、具有遗传抑郁基因的Flinder Resistant Line(FSL)大鼠[5]、Sprague dawley(SD)大鼠[6]、天生嗜酒的Fawn Hooded(FH)大鼠[7]和脑内5-HT活力低下的Tryon Maze Dull(TMD)大鼠等；每种大鼠模型均具有自己的优缺点[2]。然而目前还并没有一个动物模型能够完全涵盖所有的抑郁症状。因此，可以联用多种造模方法以建立较为全面、与人类抑郁症状更为相似的动物模型，从而提高实验结果的可信度。

一个理想的抑郁症动物模型应该具有良好的表观信度、内在信度和预测信度；也就是动物行为特点和人抑郁症症状相似，动物模型的病理生理机制与人类相同，人类有效抗抑郁药物对动物有效[8]。目前抑郁症动物模型的观测指标[1]主要包括：表观指标、生化指标、病理学指标。表观指标为Ⅰ类指标(核心指标)，模型制备成功后，动物有食欲下降、体重减轻、活动性显著降低等表现。抑郁症的病因并不清楚，发病机制比较复杂，多数学者将其归因于单胺类神经递质假说，因此认为5-HT失常是抑郁症的生化基础之一。临床诊断不使用病理学指标作为抑郁症诊断的指标，该指标主要用于对动物模型的研究中。

抑郁症动物模型制备规范草案提示，研究者应根据各类指标对抑郁症模型的贡献不同进行分级，尽量将单纯的定性描述转变成可量化或半量化的指标，提高判定的可控性。抑郁症模型每次造模可能会出现不同的总积分，总积分可以有20%左右的偏差，所得总积分应>0.5，则可认为该模型制备成功。本研究参考了草案所采用的计算方法及三类指标的权重分值，同时也按草案建议根据不同制备模型方法及所观测指标的不同对计算方法进行了适当调整。

本研究分别从生理及行为学指标、生化指标、病理学指标这3个方面验证狭小空间大鼠抑郁症模型。与正常对照组相比，M组的表观指标包括体重、饮水量、进食量、糖水偏好度、活动行为均明显降低，海马组织中5-HT的含量显著下降，且组织呈现弥散性损伤，在这三方面均达到了造模的要求。而本模型造模仅需要将体重在规定区间范围内的大鼠饲养在孤立与狭小的鼠笼中，使其虽能正常饮水进食但行为上的自由活动受限，操作简便，不会导致动物死亡或过于烦躁攻击实验人员。相较于经典的慢性CUMS[9]，本造模方法的优点在于：便于操作，重复性强，不损失实验动物。慢性不可预见应激模型可模拟生活中遇到的各种刺激因素，造成动物心理上的抑郁。CUMS模型刺激方法[10]包括：禁水、禁食、夹尾、冰水游泳、鼠笼倾斜、日夜颠倒等不下10种，3～4周内每天随机给予1种刺激，使动物无法预料给予何种刺激从而避免适应。此种模型制备方法复杂多样，操作相对繁琐，重复性差，工作量大[11]，时间成本高，重复性、可靠性差[12]。刺激方法中的冰水游泳易使动物因低温死亡，夹尾刺激易使动物过于烦躁攻击实验人员。CUMS模型可以根据研究目标药物的可能作用机制、药物起效快慢或疗程来确定CUMS周期和适宜的给药时间。也因此，CUMS模型存在几方面问题：应激项目没有公认的选择方案，应激的操作顺序没有统一规范，各应激的刺激强度没有统一标准，各应激操作时间安排未作详细叙述等，认为，未来CUMS模型的发展需要将上述几方面考虑在内，更严格规范CUMS操作规程，是保证模型稳定性和可复制性的重要前[13]。

总之，本研究采用狭小空间方法成功构建抑郁症大鼠模型(M)，并且本模型能够缩短抑郁症模型的成模时间。方法简便、稳定、省时和造模效果好，为抑郁症模型大鼠模型的构建提供一种安全有效的新方法。