黑果腺肋花楸有效物质的提取及抗氧化和降糖活性研究

张家豪，马 芹

(1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000； 2.新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆 乌鲁木齐 830011)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又称野樱莓、不老莓，是蔷薇科腺肋花楸属植物[1]。黑果腺肋花楸的果实呈球形，果肉为黑色，果汁为暗红色，口味酸甜，具有较强的耐寒性，喜湿润和透气性良好的土壤，能在-45 ℃的寒冷环境下生存，是集食用、药用、园林和生态价值于一身的喜阳耐寒落叶灌木[2]。原产自美国东北部[3]，上世纪90年代引种至我国，先后引进了8个品种[4]。

黑果腺肋花楸中最重要活性成分是多酚类化合物，包括高浓度的花色苷、黄酮类化合物、原花青素及酚酸等，具有较强的抗氧化活性[5-6]。研究[7]表明，黑果腺肋花楸中多酚类化合物含量达到2.5%～3.5%，约是蓝莓的5倍、越橘的15倍、黑莓的10倍、覆盆子的20倍以及葡萄的80倍。此外，黑果腺肋花楸中黄酮类化合物含量(高达0.25%～0.35%)丰富[8-9]，是已知植物中含量最高的。欧美和东亚一些国家以黑果腺肋花楸为原料生产的食品、药品、化妆品、保健品等产品十分丰富，相关产业已建立完善，取得了可观的经济效益。尽管如此，国内对于黑果腺肋花楸的利用主要体现在园林绿化方面，对其果实加工及在食品和药品等方面的开发研究还处于起步阶段[10]。鉴于此，作者建立了黑果腺肋花楸多酚和黄酮的超声辅助提取法，采用单因素实验和正交实验并通过多指标综合评分法优化提取工艺；通过对DPPH的清除能力评价其抗氧化活性；并通过建立肝细胞高糖损伤模型，比较提取物组与模型组葡萄糖消耗量评价其降糖活性，为黑果腺肋花楸保健品的进一步开发利用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

黑果腺肋花楸(批号：20180606、20180706、20180806)，产自新疆塔城裕民县；人肝LO2细胞系，购于上海细胞典藏中心。

没食子酸标准品(110831-200803)、芦丁标准品(110742-201622)，中国食品药品研究院；维生素C(191202)，四川依科制药有限公司；GLU葡萄糖检测试剂盒(20191207137)，南京建成生物工程研究所；其它试剂，市售。

KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；TD2002型电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；2323-2型CO2细胞培养箱，美国谢尔登公司；Model-680型酶标仪，BIO-RAD公司。

1.2 黑果腺肋花楸有效物质的提取

称取一定量黑果腺肋花楸，按一定液料比加入一定体积分数的乙醇打浆，在一定超声功率下提取一定时间，除去滤渣及乙醇，得黑果腺肋花楸提取液。将提取液挥去大部分水分得浸膏，然后置于真空干燥箱中烘干得干膏，称重。出膏率=(干膏质量/黑果腺肋花楸质量)×100%。

采用单因素实验和正交实验优化提取工艺。

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 乙醇体积分数的影响

精确称取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1(mL∶g，下同)加入体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇打浆，在超声功率180 W下提取50 min，提取温度为50 ℃，除去滤渣及乙醇后，测定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察乙醇体积分数对多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响。

1.2.1.2 超声功率的影响

精确称取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打浆，在超声功率分别为80 W、100 W、120 W、140 W、160 W、180 W、200 W下提取50 min，提取温度为50 ℃，除去滤渣及乙醇后，测定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察超声功率对多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响。

1.2.1.3 提取温度的影响

精确称取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打浆，在超声功率180 W下提取50 min，提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，除去滤渣及乙醇后，测定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察提取温度对多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响。

1.2.1.4 提取时间的影响

精确称取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打浆，在超声功率180 W下分别提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，提取温度为50 ℃，除去滤渣及乙醇后，测定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察提取时间对多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响。

1.2.1.5 液料比的影响

精确称取一定量黑果腺肋花楸，分别按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入60%乙醇打浆，在超声功率180 W下提取50 min，提取温度为50 ℃，除去滤渣及乙醇后，测定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察液料比对多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响。

1.2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，选取超声功率、提取时间、乙醇体积分数、液料比为考察因素，以多酚含量、黄酮含量和出膏率为考察指标，进行L9(34)正交实验，采用多指标综合评分法对实验结果进行分析，优化提取工艺。

1.3 多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法(福林酚试剂法)，以没食子酸为标准品，参考GB/T 8313-2008[11]方法绘制没食子酸的标准曲线。精确称量适量没食子酸，加蒸馏水配制成1.0 mg·mL-1的没食子酸储备液。准确吸取2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL没食子酸储备液，分别置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得到浓度(μg·mL-1)分别为20、30、40、50、60 的没食子酸标准溶液。分别取1 mL各浓度没食子酸标准溶液置于10 mL容量瓶中，加入1 mL 50%福林酚试剂、3 mL 7.5%碳酸钠溶液、5 mL蒸馏水，避光显色2 h后，测定其在765 nm处吸光度值。以没食子酸浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线，拟合得线性回归方程。

准确吸取1 mL黑果腺肋花楸提取液，按上述方法测定765 nm处吸光度值，根据回归方程计算多酚浓度，按式(1)计算提取液中多酚含量(mg·g-1)：

(1)

式中：c为提取液中多酚浓度，mg·mL-1；V为待测提取液体积，mL；n为提取液的稀释倍数；m为黑果腺肋花楸质量，g。

1.4 黄酮含量的测定[12]

精确称取适量105 ℃干燥至恒重的芦丁标准品，加甲醇溶解并定容，配制成150 μg·mL-1的芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇至5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后静置5 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，振摇后静置6 min；再加入4.3%氢氧化钠溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，测定其在510 nm处吸光度值。以芦丁浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制芦丁标准曲线，拟合得线性回归方程。

准确吸取1 mL黑果腺肋花楸提取液，按上述方法测定510 nm处吸光度值，根据回归方程计算黄酮浓度，按式(2)计算提取液中黄酮含量(mg·g-1)：

(2)

式中：m1为根据标准曲线计算出的待测液中黄酮量，μg；m为黑果腺肋花楸质量，g；V1为待测液体积，mL；V2为提取液总体积，mL。

1.5 抗氧化活性评价

称取一定量DPPH溶于无水乙醇中，配制成100 μg·mL-1的DPPH母液，置于遮光瓶中，-20 ℃下保存。将DPPH母液稀释至50 μg·mL-1[13]，于96孔板中每孔加入100 μL，然后按浓度梯度加入100 μL VC溶液或100 μL黑果腺肋花楸提取液；置于37 ℃烘箱中避光反应30 min，用酶标仪测定490 nm处吸光度值，并计算IC50值。

1.6 降糖活性评价

1.6.1 黑果腺肋花楸提取物溶液的配制

将黑果腺肋花楸干膏溶于4% DMSO溶液中，配制成5 mg· mL-1的母液A；用4% DMSO溶液稀释得到1 mg· mL-1的母液B；母液A、B各2倍稀释共得14个浓度(1 000～3.125 μg·mL-1)的黑果腺肋花楸提取物溶液。

1.6.2 对LO2细胞增殖的毒性研究(MTT法)[14]

对LO2细胞进行复苏传代[15]，取对数生长期的LO2细胞，制成细胞悬液并进行细胞计数后，接种至96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；按浓度梯度将黑果腺肋花楸提取物溶液依次加入到96孔板中，每孔40 μL，然后每孔补加60 μL培养基，继续培养20 h；每孔加入20 μL MTT溶液，在37 ℃下培养4 h，弃去培养液；每孔加入100 μL DMSO溶液，振摇10 min，用酶标仪测定490 nm处吸光度值，取平均值，计算存活率，选取其中5个结果相近且差异较小的浓度进行降糖作用研究。

1.6.3 对LO2细胞的降糖作用

对LO2细胞进行复苏传代[15]，取对数生长期的LO2细胞，制成细胞悬液并进行细胞计数后，接种至96孔板中，贴壁培养12 h，弃去培养基；用PBS缓冲液洗涤2～3次，弃去洗涤液，每孔加入100 μL无糖培养基；提取物组与肝细胞高糖损伤模型组加入50 μL 25 mmol·L-1的葡萄糖溶液，对照组与空白组加入50 μL无糖培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h；向提取物组与对照组加入MTT实验选取的5个浓度的提取物溶液，按照浓度梯度每孔加40 μL，然后再补加10 μL无糖培养基，模型组与空白组每孔补加50 μL无糖培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。按葡萄糖检测试剂盒的使用说明进行检测，另取一个新的96孔板，分为样本组、校准组、质控组及空白组；每孔加入200 μL葡萄糖试剂为底液，样本组每孔加2 μL提取物溶液并混匀；校准组加入2 μL校准液；质控组加入2 μL质控液；空白组加入2 μL无糖培养基，于37 ℃反应10 min，用酶标仪测定490 nm处吸光度值，每组取平均值，按式(3)计算葡萄糖浓度(mmol·L-1)：

(3)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数的影响(表1)

表1 乙醇体积分数对黑果腺肋花楸多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响

从表1可知，乙醇体积分数在40%～80%时，随着乙醇体积分数的增大，多酚含量先升高后下降，黄酮含量总体逐渐升高，出膏率总体呈先下降后升高的趋势。这是由于，多酚在植物中与蛋白质等物质一般通过氢键形式结合，乙醇体积分数较小时，不足以破坏氢键或者破坏程度不够，而乙醇体积分数较大时，则会降低溶剂极性。当乙醇体积分数为50%时，多酚含量最高，为6.010 mg·g-1；当乙醇体积分数为70%时，黄酮含量最高，为10.237 mg·g-1；出膏率在乙醇体积分数为40%和80%时较高，分别为16.42%和17.12%。表明乙醇体积分数对黑果腺肋花楸有效物质的提取影响较大。

2.1.2 超声功率的影响(表2)

从表2可知，超声功率在80～200 W时，多酚含量、黄酮含量、出膏率均先下降再升高而后再下降。当超声功率为80 W时，多酚含量最高，为6.965 mg·g-1；当超声功率为140 W时，黄酮含量和出膏率最高，分别为12.588 mg·g-1、18.95%。表明超声功率对黑果腺肋花楸有效物质的提取影响较大。

表2 超声功率对黑果腺肋花楸多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响

2.1.3 提取温度的影响(表3)

表3 提取温度对黑果腺肋花楸多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响

从表3可知，随着提取温度的升高，多酚和黄酮的含量基本不变，处于一个相对稳定的状态；而出膏率呈缓慢下降的趋势。表明提取温度对黑果腺肋花楸有效物质的提取影响较小。综合考虑，确定最佳提取温度为40 ℃。

2.1.4 提取时间的影响(表4)

从表4可知，随着提取时间的延长，多酚含量、黄酮含量、出膏率均先升高后下降至平稳状态。多酚含量、黄酮含量在20 min时达到最高，分别为6.968 mg·g-1、14.125 mg·g-1；出膏率在30 min时达到最高，为18.59%。表明提取时间对黑果腺肋花楸有效物质的提取影响较大。

2.1.5 液料比的影响(表5)

表4 提取时间对黑果腺肋花楸多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响

表5 液料比对黑果腺肋花楸多酚含量、黄酮含量和出膏率的影响

从表5可知，随着液料比的增大，多酚含量、黄酮含量均先升高后下降，出膏率则先升高后缓慢下降至平稳状态。这是由于，当原料质量一定时，增加溶剂用量有利于原料中有效成分向提取液中扩散，则多酚含量、黄酮含量升高；当溶剂增加到一定量时，原料中的有效成分大多已经溶解在提取液中了，继续增加溶剂用量，多酚含量、黄酮含量不再升高。当液料比为15∶1时，多酚含量最高，为6.021 mg·g-1；当液料比为20∶1时，黄酮含量、出膏率最高，分别为9.270 mg·g-1、15.74%。表明液料比对黑果腺肋花楸有效物质的提取影响较大。

2.2 正交实验结果

采用多指标综合评分法，以各指标的最大值为参照将数据统一化，多酚含量(X)赋权30%，黄酮含量(Y)赋权30%，出膏率(Z)赋权40%，综合评分W=(0.3X/6.462+0.3Y/12.121+0.4Z/18.03)×100，对实验结果进行直观分析和方差分析，确定最佳提取工艺。正交实验的因素与水平见表6，直观分析见表7，方差分析见表8。

表6 正交实验的因素与水平

表7 正交实验的直观分析

表8 正交实验的方差分析

由表7可知，各因素的影响大小顺序为B>A>D>C；各因素影响趋势为：B1>B3>B2，A3>A2>A1，D1>D3>D2，C3>C1>C2；理论最佳提取工艺为A3B1C3D1。由表8可知，因素B有显著性差异，因素A、C、D均无显著性差异。根据节能及安全方面考虑，确定最佳提取工艺为A3B1C1D1。综合单因素实验和正交实验结果，确定最佳提取工艺为：超声功率120 W、提取时间10 min、乙醇体积分数50%、液料比10∶1、提取温度40 ℃。

2.3 验证实验结果

在最佳提取工艺下，进行三批次工艺验证实验，结果见表9。

表9 工艺验证实验结果

由表9可知，三批次工艺验证实验结果评分均达到或超过95.0，且多酚含量、黄酮含量和出膏率的RSD分别为1.60%、2.27%、0.90%，表明该工艺稳定可行。

2.4 黑果腺肋花楸提取液的抗氧化活性(图1)

图1 不同浓度VC和黑果腺肋花楸提取液的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of VC and Aronia melanocarpa extract solution with different concentrations

从图1可知，VC与黑果腺肋花楸提取液的IC50值分别为9.550 μg·mL-1、0.355 mg·mL-1，根据黑果腺肋花楸出膏率为17%，将其IC50值换算为相同浓度单位，为60.350 μg·mL-1。研究[16]表明，桑葚、黑加仑和蓝莓提取物的抗氧化活性大小为桑葚>黑加仑>蓝莓，且桑葚提取物的抗氧化活性远高于蓝莓和黑加仑提取物，其IC50值依次为0.953 mg·mL-1、8.112 mg·mL-1、8.911 mg·mL-1；而本实验中黑果腺肋花楸提取液的IC50值小于桑葚提取物，相较于其它浆果，黑果腺肋花楸提取液的IC50值与VC更为接近。因此，黑果腺肋花楸提取液有较强的抗氧化活性。

2.5 黑果腺肋花楸提取物的降糖活性

2.5.1 MTT法优选浓度

LO2细胞毒性实验结果显示，加入14个浓度(1 000～3.125 μg·mL-1)的黑果腺肋花楸提取物溶液培养的LO2细胞活力较好，黑果腺肋花楸提取物溶液对LO2细胞的增殖无显著抑制作用，表明浓度为1 000～3.125 μg·mL-1的黑果腺肋花楸提取物溶液无肝细胞毒性。选取200 μg·mL-1、125 μg·mL-1、100 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、50 μg·mL-15个浓度的黑果腺肋花楸提取物溶液培养LO2细胞进行降糖实验，其LO2细胞的存活率如图2所示。

图2 LO2细胞存活率Fig.2 Survival rate of LO2 cell

2.5.2 葡萄糖含量检测结果(图3)

注：**，P≤0.01，表示与模型组相比具有显著性差异

葡萄糖含量越少，则消耗量越多，即降糖效果越好。从图3可知，加入黑果腺肋花楸提取物溶液后，葡萄糖含量明显下降；加入的提取物溶液浓度越高，葡萄糖含量越少。与肝细胞高糖损伤模型组相比，提取物组葡萄糖消耗量显著提升(P≤0.01)，由5.59 mmol·L-1·(24 h)-1升至8.29 mmol·L-1·(24 h)-1。表明黑果腺肋花楸提取物具有较强的降糖活性。

3 结论

建立了黑果腺肋花楸多酚和黄酮的超声辅助提取法，采用单因素实验和正交实验并通过多指标综合评分法优化提取工艺。确定黑果腺肋花楸多酚和黄酮的最佳提取工艺为：超声功率120 W、提取时间10 min、乙醇体积分数50%、液料比10∶1(mL∶g)、提取温度40 ℃。黑果腺肋花楸提取物的IC50值(60.350 μg·mL-1)与VC的相近，具有较强的抗氧化活性；黑果腺肋花楸提取物溶液(1 000～3.125 μg·mL-1)无肝细胞毒性，且与肝细胞高糖损伤模型组相比，提取物组葡萄糖消耗量显著提升，由5.59 mmol·L-1·(24 h)-1升至8.29 mmol·L-1·(24 h)-1，具有较强的降糖活性。该方法操作简便、绿色无污染、提取率高，为黑果腺肋花楸的工业化生产奠定了基础。