基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及GNPS技术的炮附片二萜类生物碱成分*

范倩，陈雪冰，汪玉梅，荣莉，张翠仙

广州中医药大学中药学院，广东广州510006

附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx. 子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳，散寒除湿之功效等［1］。临床用于治疗阴盛格阳，大汗亡阳，风寒湿痹等疾病。文献研究表明［2-4］附子的化学成分主要为生物碱、有机酸类、脂肪酸酯和微量元素等，其中生物碱为主要活性成分，具有强心、抗炎和抗风湿性关节炎等药理作用。附子生物碱主要包括双酯型二萜类生物碱、长链脂型二萜类生物碱、单酯型二萜类生物碱、无酯型二萜类生物碱和其他类型生物碱。其中双酯型和单酯型二萜类生物碱也为其毒性成分。由于附子属于大毒药材，临床常用其炮制品，炮制过程中双酯型生物碱水解成单酯型生物碱，毒性显著降低等［5］。近年来，将液相色谱的高效分离能力和高分辨质谱鉴定能力相结合，广泛用于中药材成分分析与鉴定［6］。GNPS（global natural products social molecular networking）是一种可视化计算策略，可以直观地观察到样品LC-MS/MS 实验中检测到的所有分子离子以及这些分子离子之间的化学关系，对于化合物的快速而大规模地鉴定及新颖化合物发现具有重要的作用［7］。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 及GNPS 技术对炮附片在线分离分析，快速鉴定其二萜类生物碱成分，为其药效物质基础及质量控制研究奠定基础。

1 仪器与材料

Triple-TOFTM 5600+型三重四级杆飞行时间质谱（美国AB SCIEX 公司）。超高效液相系统：LC-30AD 高效液相色谱仪、SIL-30AC 自动进样器（日本Shimadzu 公司）；煎煮锅（广州文新电器有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；卢湘仪DD-5M 低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Sartorius 赛多利斯十万分之一天平（季尔国际贸易有限公司）。

炮附片药材（批号YPA7H0001）购自广州采芝林药业有限公司。炮附片，经广州中医药大学黄海波教授鉴定为乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。对照品乌头碱（aconitine，批号RP170421）、 中 乌 头 碱（mesaconitine， 批 号RP170320）、 次 乌 头 碱（hypaconitine， 批 号RP170520）、3-脱氧乌头碱（3-deoxyaconitine，批号RP161108）、苯甲酰乌头原碱（benzoylaconine，批号RP170615）、苯甲酰中乌头原碱（benzoylmesaconine，批号RP170605）、苯甲酰次乌头原碱（benzoylhypaconine，批号RP170513）、乌头原碱（aconine，批号RP170517）、新乌头原碱（mesaconine，批号RP170320）、次乌头原碱（hypaconine，批 号 RP170518）、 尼 奥 林 （neoline， 批 号RP170423）、 多 根 乌 头 碱（karacoline， 批 号RP161225）、宋果灵（songorine，批号RP170402），均购自成都麦德生科技有限公司，13 种对照品纯度均≥98%。甲醇（色谱纯，德国Merck 公司），甲酸（色谱纯，美国Fisher 公司），φ=95%乙醇（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 ACE C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司），体积流量0.4 mL/min，PDA 全波长扫描，柱温30 ℃，进样量2 μL。以乙腈为流动相A，φ=0.1%甲酸水为流动相B，梯度洗脱：0～5 min，5% A；5～65 min ，5%～25 % A；65～95 min，25%～65% A；95～100 min，65%～95%A；100～105 min，95%A。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子化源（ESI），正离子扫描模式，扫描范围m/z 100～1 500，用亮氨酸脑啡肽作校正液，进行实时校正。正离子模式离子喷雾电压（ISVE）：+5 500 V；涡轮喷雾温度（TEM）：550 ℃；气帘气压力（GUR）：35 psi；雾化气（Gas1）：55 psi；辅助气（Gas2）：55 psi；解簇电位（DP）：100 V；碰撞能散布（CES）：15 eV；离子释放延迟（IRD）：67 V；离子释放宽度（IRW）：25 V 一级质谱母离子扫描范围100～1 500 ；IDA 设置响应值超过100 cps 的8 个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围：100～1 500。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品储备液的溶液 用十万分之一天平精密称取13 种附子对照品各约1.0 mg，用φ=80%的甲醇溶解，定容至1 mL 容量瓶中，分别精密吸取13 种附子对照品各0.1 mL，定容至50 mL容量瓶中，配制成质量浓度约为0.02 mg/mL 的附子混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取炮附片药材30.0 g，精密称定，加入1 L纯净水浸泡30 min，水煮2 h制成水煎液，趁热用四层纱布过滤，药渣采用此方法再煎煮一次后合并两次滤液，离心（4 000 r/min，15 min），上清滤液浓缩至约300 mL后加3倍φ=95%的乙醇沉糖，于4 ℃冰箱静置24 h，离心（4 000 r/min，15 min），上清液在50 ℃减压浓缩至粘稠状态，氮气吹干仪吹干部分溶剂，得稠浸膏。取浸膏适量，用φ=80%甲醇水配制成质量浓度约为50 mg/mL 的样品溶液，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 数据分析

2.3.1 化学数据库分析 使用Peak ViewTM软件（版本1.2，AB Sciex）对炮附片中复杂的化合物进行定性鉴别。首先，通过检索相关文献和化学数据 库 网 站（CNKI，Chemspider，Web of Science，PubMeb，SciFinder 等），建立了一个属于附子的化合物数据库，包括名称、分子式和化学结构文件。然后，将数据库导入到Peak ViewTM软件的XIC Manager 模块对目标化合物进行峰提取和匹配。提取的参数设置如下：XIC intensity ＞50 counts，S/N ＞ 10， isotope ratio% difference ＜20， mass error ＜10×10-6。经计算筛选后，软件将各化合物的实测数据与软件理论的数据进行匹配，将匹配度大于75%且质谱碎片裂解过程合理的结果作为炮附片中最终鉴定出来的化合物。

2.3.2 GNPS 网络的建立 按照“2.1”项下优化的色谱及质谱条件进样，获得正离子模式下炮附片样品及混合对照品溶液的UPLC-Q-TOF-MS/MS二级质谱文件，通过MS Convert 软件转换后利用FileZilla FTP Client 连接器导入GNPS 平台（http：//gnps. ucsd. edu），分别建立GNPS 网络，并与混合对照品和谱库中的数据进行匹配；数据分析在Cytoscape 3.6.1 软件中进行。

3 讨 论

3.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS 条件优化及参数设置

中药炮附片的提取物成分复杂多样。通过与样品的正负离子响应度比较，发现正离子比负离子具有更好的响应。为了有足够的碎片信息用于结构鉴定分析，以13 种生物碱溶液的对照品为参考，选择20、30、40 和50 eV 的碰撞能量（CE）进行优化以获得合适的产物离子，最后选择40 eV作为最佳CE。

本实验采用了四极杆飞行时间串联质谱（QTOF-MS/MS），无论是在MS 或MS/MS 模式下均具有高分辨能力，在实现UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析时其主要优点是应用质谱的高分辨精确质量数进行化合物的定性分析，加上MS/MS 数据以推测分子结构，对于高分辨率质谱通常要求仪器的质量测量准确度小于10×10-6［8-10］，才能满足定性分析的需要；利用Peak ViewTM软件里的XIC Manager 模块对化学数据库里化合物进行峰提取和匹配的参数的筛选标准限值，该匹配度仅作为一个化合物定性分析的初步筛选标准，提取并突出显示初步符合数据库要求的化合物；同时，我们也参考了相关的文献（如：复方白术芍药散成分分析）［8］里该匹配度值的设置情况。故本实验选用了mass error ＜10×10-6作为质量测量准确度的标准，匹配度大于75%作为炮附片的定性分析的初步标准。此外，化合物的定性分析需要同时满足质量测量准确度（mass error） 小于10×10-6和匹配度大于75%，并需结合各化合物的特征二级碎片离子等，最终才能鉴定化合物的结构。

3.2 炮附片的成分鉴定

按照“2.1”项下优化的色谱及质谱条件进样，获得UPLC-Q-TOF-MS/MS 正离子模式下炮附片样品和混合对照品溶液的TIC图（见图1）。按照“2.3”项下数据分析方法确定化学成分的结构，对炮附片主要成分进行快速表征，共鉴定了123个化合物（见表1、表2），其中包括双酯型生物碱21个，脂型生物碱11 个，单酯型生物碱43 个，无酯型生物碱47 个，多酯型生物碱1 个，其中包括34个潜在的新化合物。

3.2.1 通过数据库和Peakview 对二萜类生物碱的成分鉴定

1） 双酯型二萜类生物碱。

双酯型二萜类生物碱（DDAs）是附子的主要生物活性成分，通过建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鉴别了17 种双酯型二萜类生物碱，该类化合物的主要裂解特征为容易脱去取代基，如羟基、甲氧基、乙酰基、苯甲酰基等，而丢失CO、H2O、CH3OH、AcOH、BzOH 等中性分子。化合物77、94、103 和109 通过对照品无偏差的鉴别为aconitine、mesaconitine、hypaconitine 和3-deoxyaconitine。为帮助鉴定和证实其他双酯型二萜类生物碱，我们首先对mesaconitine 对照品的碎片裂解途经进行分析，在正离子模式检测下，化合物94 （mesaconitine） 给出了明显的m/z 632.305 4 ［M+H］+的分子离子峰， 二级质谱图（图2A）可观察到碎片离子m/z 582.269 1［M+HCH3OH-H2O］+、572.280 9［M+H-AcOH］+、540.256 2［M+H-AcOH-CH3OH］+、512.261 9［M+H-AcOHCH3OH-CO］+、508.231 8［M+H-AcOH-2CH3OH］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、390.228 0［M+H -AcOH-CH3OH-CO-BzOH］+、354.169 0［M+HAcOH-CH3OH-CO-BzOH-2H2O］+；其裂解规律如图3所示。其他双酯型生物碱（化合物72、81、84和108）均有类似的质谱裂解规律，根据质谱数据结合文献报道［11］，分别鉴定为17-dihydronapelline、3*、10-hydroxymesaconitine、chasmaconitine。研究发现化合物74 和化合物94（mesaconitine）具有相同的分子式C33H45NO11，其为mesaconitine的同分异构体。 其二级质谱中形成的m/z 572.280 9［M+H-AcOH］+主要碎片离子，同时观察到其碎片离子m/z 540.258 0［M+H-AcOHCH3OH］+、508.265 9［M+H-AcOH-2CH3OH］+。但因未发现［M+H-H2O］+和［M+H-CH3OH -H2O］+等与脱去H2O相关的碎片离子，说明其C3位未有羟基取代，根据文献［12］比对，推测化合物74 其可能为10-OH-hypaconitine。类似地，其他双酯型二萜类生物碱化合物，根据质谱数据，结合文献报道及ClogP 值［8，10-11］，79、82、91、95、96、102和110～112逐一被鉴定（表1）。

图1 炮附片（A）和混合对照品溶液（B）的UPLC-Q-TOF-MS/MS 总离子流图Fig.1 The total ion chromatograms of PAC and mixed reference solution by UPLC-Q-TOF-MS/MS

表1 炮附片中已知二萜类生物碱离子结构信息1）Table 1 Characterization of known diterpenoid alkaloids of PAC by UPLC-Q-TOF-MS/MS

续表

续表

续表

表2 炮附片中新二萜类生物碱离子结构信息1）Table 2 Characterization of new diterpenoid alkaloids of PAC by Molecular Networking

续表

2） 长链脂型二萜类生物碱。

长链脂型二萜类生物碱（Lipo-As）是附子中特有的一类生物活性成分，该类化合物的主要质谱裂解特征为首先脱去C-8 为对应的长链脂肪酸（-lipo）后，再与其相对应的双酯型二萜类生物碱［M+H-AcOH］+的骨架的二级质谱裂解规律是一致的［15］。基于此裂解规律，从炮附片中一共鉴定到了11 个长链脂型生物碱。例如，化合物122 的准分子离子峰为m/z 812.531 2［M+H］+，分子式为C47H73NO10。二级质谱图如图2 B 可观察到碎片离子m/z 556.289 2［M+H-lipo］+、524.262 6［M+H-lipo-CH3OH］+、496.269 5［M+H-lipo- CH3OH-CO］+、338.172 5［M+H-lipo-3CH3OH-BzOH］+。其二级质谱和benzoylhypaconine 二级质谱一致，因此，该化合物的骨架初步鉴定为benzoylhypaconine，其长链脂肪酸的分子式为C16H32O2，推测长链脂肪酸初步为palmitic acid （pal）。根据其质谱数据结合文献报 道［11］，化 合 物122 鉴 定 为8-pal-benzoylhypaconine。此外，其他长链脂型二萜类生物碱化合物也有类似的裂解规律，根据其质谱数据结合文献报道［12-13］，化合物113～117、119～123 逐一被鉴定表征（表1）。

3） 单酯型二萜类生物碱。

单酯型二萜类生物碱（MDAs）是炮附子中主要的低毒活性成分，通过建立的LC-MS 方法在炮附片的水煎液中一共鉴别了34 种单酯型二萜类生物碱，其裂解规律为容易失去AcOH、CH3OH、H2O、CO 等中性分子。化合物67、73 和75 通过对照品无偏差的鉴别为benzoylmesaconitine，benzoylaconine 和benzoylhypaconine。为鉴定和证实其它单酯型二萜类生物碱，首先对benzoylaconine 对照品的碎片裂解途经进行分析，在正离子模式检测下，化合物73（benzoylaconine）给出了明显的m/z 604.312 0［M+H］+的分子离子峰， 二级质谱图（图2C）可观察到碎片离子m/z 586.300 8［M+HH2O］+、572.285 6［M+H-CH3OH］+、554.275 2［M+H-H2O-CH3OH］+、540.259 3［M+H-2CH3OH］+、522.248 9［M+H-2CH3OH -H2O］+、508.233 6［M+H -3CH3OH］+、490.222 4［M+H-3CH3OH-H2O］+、428.186 6［M+H-BzOH-3H2O］+；此外，其他单酯型二萜类生物碱均有类似的质谱裂解规律，根据质谱数据结合文献报道［11-12，14-16］，化合物1、24、26、37、47、53、54、56、57、65、76、80、88、90、93、98 和99 逐一分别被鉴定。在正离子模式下，化合物62出现m/z 604.312 2［M+H］+的准分子离子峰，它的二级质谱数据与benzoylaconine 相类似，二级质谱图同样可观察到m/z 572.287 7、554.277 5和522.251 1等碎片离子，对比之下化合物62 还具有m/z 458.198 9［M+H-4CH3OH-H2O］+、336.159 4［M+H-4CH3OH-BzOH-H2O］+特征的碎片离子，暗示其比benzoylaconine 多一个-OCH3，根据质谱数据结合文献报道［12］，推测其结构为hukbusine A。其他单酯型二萜类生物碱化合物均有类似的质谱裂解规律，根据其质谱数据结合文献报道及ClogP 值［11，17-19］，化合物69、71、78、83、85～87、100、101和104～107逐一被鉴定（表1）。

图2 Mesaconitine（A）、8-pal-benzoylhypaconine（B）、benzoylaconine（C）、neoline（D）、PAC-2#（E）和PAC-16#（F）的二级质谱图Fig.2 The MS2 spectra of mesaconitine（A），8-pal-benzoylhypaconine（B），benzoylaconine（C），neoline（D），PAC-2#（E）and PAC-16#（F）

4） 无酯型二萜类生物碱。无酯型二萜类生物碱（ADAs）是炮附子中主要的无毒活性成分，通过建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鉴别了25 种无酯型二萜类生物碱，化合物12、15、20、23、28 和33 通过对照品无偏差的鉴别为mesaconine、karakoline、songorine、aconine、hypaconine 和neoline；以化合物33 为例，说明无酯型二萜类生物碱的裂解规律。化合物33 二级质谱图如 图2D 可 观 察m/z 420.274 7［M+H-H2O］+、402.264 1［M+H-2H2O］+、388.248 6［M+H-H2OCH3OH］+、370.237 9［M+H - 2H2O - CH3OH］+、356.222 2［M+H-H2O -2CH3OH］+等碎片离子，根据对照品的质谱信息和参考文献报道［12］，化合物33 初步鉴定为neoline。而化合物36 的裂解方式和化合物33 的相似，它的二级质谱数据与neoline 相类似，二级质谱图同样可观察到m/z 420.274 0、388.248 6、360.217 5 等碎片离子，对比之下，化合物36 还形成m/z 406.259 4 的主要的特征二级碎片离子，是在m/z 438.285 3 的母离子脱去C1位的-CH3OH 产生的，表明其C1是甲氧基取代。根据质谱数据并结合参考文献［11］，因此推测其结构为foresticine。其他无酯型二萜类生物碱化合物类似的质谱裂解规律，根据其质谱数据结合文献报道及ClogP 值［11-13，15-16］，化 合 物2，4，6～9，14，29，40和48逐一被鉴定（表1）。

3.2.2 通过GNPS 网络对二萜类生物碱的成分鉴定 基于MS/MS 光谱的相似性，炮附片水煎煮液的可视化的分子笼网络被建立（https：//gnps. ucsd. edu/ProteoSAFe/status. jsp？task=7c62374c03854 e01ad1ad354134c7616）。在4 个明显的二萜类生物碱分子笼中，通过GNPS 网络和已知化合物的去重复分析，共初步鉴定了65 个生物碱，其中包括34个潜在的新生物碱（表2和图4）。

图3 Mesaconitine的质谱裂解规律图Fig.3 The proposed fragmentation pathways of mesaconitine

在正离子模式下，分子笼Ⅰ共包含了36 个节点，相对分子质量范围在m/z 320.114～588.280 之间，结构涉及单酯型和无酯型生物碱（图5A）。特别地，通过对比对照品（表1），节点m/z 378.264［M+H］+被鉴定为已知化合物karakanine（18）。此外，通过文献报道和数据库分析［11］，节点m/z 420.275（35）和392.280（1）［M+H］+分别被鉴定为N-ethylhokbusine B（35）和hukbusine B 或它的同分异构体（1）。与此同时，如图分子笼I 所示，未知离子m/z 396.264 与已知离子m/z 378.264 相关，表明它们在结构上类似。节点m/z 396.264 产生的准分子离子峰为396.236 3［M+H］+，其二级碎片为m/z 378.254 5［M+H-H2O］+、360.244 2［M+H-2H2O］+、342.234 7［M+H-3H2O］+、324.223 6［M+H-4H2O］+、268.203 9［M+H-2CH3OH-H2O-CO］+，二级质谱显示有多个中性水分子的丢失，推测结构中存在多个羟基，基于质谱数据分析，节点m/z 396.26 被鉴定为karakoline 的衍生物（PAC-2#（5），表2 和图4）。此外未知离子m/z 434.290 比已知离子m/z 420.275 高出14 ，节点m/z 434.290 的准分子离子峰为396.236 3［M+H］+，其二级碎片为402.255 3［M+H-H2O］+、384.249 5［M+H-2H2O］+、342.243 2［M+H-AcOH］+、324.233 2［M+H-AcOH-H2O］+、292.204 6［M+H-AcOH-H2OCH3OH］+，二级质谱显示有中性乙酸分子的丢失，推测结构中存在1 个乙酰基，基于文献报道［11］结合质谱数据，节点m/z 434.290 被鉴定为N-ethylhokbusine B 的衍生物（PAC-16#（50），表2 和图4）。通过GNPS 网络分析，在分子笼Ⅰ中，我们共鉴定了26 个生物碱，其中包含15 个新的生物碱。此外，在分子笼Ⅱ中共鉴定21 个生物碱，其中包含11 个新的生物碱；在分子笼Ⅲ中共鉴定7 个生物碱，其中包含1个新的生物碱；在分子笼Ⅳ中共鉴定11 个生物碱，其中包含7 个新的生物碱（表2和3，图5C～D）。最后将通过GNPS 分子网络推导的所有潜在的新化合物结构分别输入Sci Finder 数据库搜索验证，发现其34 个潜在的化合物均未见相关文献报道，故推测此34 个潜在的化合物均为炮附片中潜在的新化合物。

4 结 论

图4 炮附片中新二萜类生物碱成分Fig.4 The structures of the new diterpenoid alkaloids compounds identified from PAC

图5 炮附片中4个二萜类生物碱分子笼Fig. 5 The 4 clusters of the diterpenoid alkaloids from PAC

为全面分析炮附片的二萜类生物碱成分并挖掘其潜在的新成分，本研究采用了GNPS 分子网络结合UPLC-Q-TOF-MS/MS 策略，对PAC 的成分进行快速表征。并根据化合物之间的MS/MS 相似性，PAC 提取物的GNPS 分子网络被建立，通过GNPS分子网络去重复分析，成功地鉴定了与二萜类生物碱相关的4个分子笼。利用上述方法在PAC提取物中共鉴定了123 个二萜类生物碱，其中包括34个新二萜类生物碱。这些发现极大地扩展了我们对炮附片的化学物质基础的认识，有助于为进一步全面了解其药理活性，药效物质基础及质量控制研究奠定了基础。