黄芪注射液联合阿托伐他汀对急性肺损伤大鼠肺纤维化及细胞黏附功能的影响

周 易, 李火平, 夏光明, 周 帆, 金朝霞, 张 慧

(湖北省黄冈市中心医院/长江大学附属黄冈医院，湖北 黄冈 438000)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI )是指由严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭，临床表现为呼吸频数和呼吸窘迫。ALI早期即可出现纤维化改变，临床治疗药物及其效果有限。黄芪味甘性温，归肺、脾经，是一种重要的补气药，对急性肺损伤肺纤维化有明显的抑制作用[1]。同时有研究表明，阿托伐他汀能通过多种途径发挥对急性肺损伤的的保护作用[2]。但两者合用对急性肺损伤肺纤维化的治疗鲜有报道。本课题拟以病理学观察为依据，验证黄芪联合阿托伐他汀对肺纤维化的保护作用，同时阐述其对细胞黏附功能可能的影响机制，为临床治疗肺损伤肺纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料:Wistar大鼠60只，雌雄不限，体重200～240g，由武汉大学实验动物中心提供。黄芪注射液购自成都地奥制药有限公司、阿托伐他汀钙片购自辉瑞公司、博来霉素购自日本化药株式会社。HyP试剂盒购自合肥莱尔。TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1多克隆抗体免疫组化试剂盒由武汉博士德生物提供。其他仪器设备均由长江大学附属黄冈市中心医院医学实验中心和病理科提供。本课题通过了院伦理委员会审查。

1.2动物模型制备与分组给药:模型制备：大鼠48只随机分为四组，每组12只，用氯胺酮麻醉后，博莱霉素注入大鼠肺内，制备急性肺损伤肺纤维化模型(经预实验证实模型制备成功)，另外12只大鼠用同样方法注入同体积生理盐水，制备假手术模型。分组给药：黄芪组和联合组每天腹腔注射给予1.0mL·kg-1·d-1的黄芪注射液，他汀组和联合组给予阿托伐他汀20mg·kg-1·d-1灌胃；同时对照组、模型组和他汀组给予腹腔注射等量生理盐水；对照组、模型组和黄芪组给予等量生理盐水灌胃。各组于第14天给药6h后处死大鼠，并迅速取出肺组织待测。

1.3观察指标

1.3.1肺组织病理学检查及评分:将标本常规处理后，HE染色光镜下观察组织病理学改变及肺泡炎程度，Masson染色观察肺纤维化程度。参照文献[3]方法确定肺泡炎和肺纤维化的病变程度并进行评分。同时进行免疫组织化学染色，观察黏附分子阳性表达情况(以光镜下观察到的棕黄色颗粒为黏附分子阳性表达)。

1.3.2各组HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表达水平测定:采用酶联免疫吸附试验，ELISA法测定HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

2 结 果

2.1各组肺组织病理学检查情况:对照组：肺组织结构清晰，无纤维化病理改变，少许棕黄色表达。模型组：正常肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，见胶原纤维增生及炎症细胞浸润，形成广泛性纤维化，棕黄色颗粒显著增多。黄芪组或他汀组：与同期模型组相比，肺间质部分有小灶状，纤维化程度有所减轻，病变范围较同期的模型组明显缩小，棕黄色颗粒表达有所减轻。联合组：病变范围及纤维化减轻更为明显，棕黄色颗粒阳性表达减少明显。见图1、图2及图3。

图1 各组肺泡炎染色图片(HE×200)

图2 各组肺纤化染色图片(Masson×200)

图3 各组肺组织黏附分子表达(免疫组化×200)

2.2各组肺泡炎和肺纤维化分级评分情况:与对照组比较，肺损伤后各组肺泡炎和肺纤维化分级评分显著升高(P<0.05)，给予黄芪或阿托伐他汀处理后评分均降低(P<0.05)，且联合组降低更明显(P<0.05)，见表1、图1及图2。

表1 各组病理学评分及HyP TNF-α ICAM-1 VCAM-1表达比较

2.3各组肺组织HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表达测定:肺损伤肺纤维化后各组HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表达明显升高(P<0.05)，但黄芪或阿托伐他汀处理后显著降低(P<0.05)，且联合用药后效果更为明显(P<0.05)，见表1。

3 讨 论

肺纤维化是许多肺部疾病的结局，是一种高度致命的疾病，可由各种已知的损伤，如感染、过敏原、毒素或辐射等引发。研究表明ALI早期即可出现纤维化改变，然而导致肺纤维化的细胞机制尚不清楚，但通常认为是肺泡上皮持续的损伤导致失调修复[4]。从肺组织病理学改变及肺泡炎和肺纤维化分级评分可知，模型组、他汀组、黄芪组及联合组肺泡炎和肺纤维化明显(P<0.05)，但用药后14d，各治疗组肺泡炎及纤维化程度明显较轻(P<0.05)，其中联合组最为显著(P<0.05)，说明黄芪注射液联合阿托伐他汀对肺泡炎及肺纤维化具有明显的保护作用，且优于单独使用。

肺纤维化是正常的肺组织被异常积累的成纤维细胞和胶原所取代。HyP在胶原中的比例相对恒定(约占13%)，是胶原蛋白的主要成分之一，在其它蛋白中较少或不存在，因此测定羟脯氨酸水平可反映胶原水平，也可间接反应肺纤维化的程度。TNF-α主要是由T细胞和单核巨噬细胞产生和释放，其在炎症中的作用机制主要是对细胞炎症反应的诱导(是一种强有力的诱导剂)、增强氧化应激、促进炎性介质的表达和释放以及对肺泡活性物质功能的损害等。TNF-α能激活促纤维化细胞因子，促进成纤维细胞增殖、趋化，缺乏TNF受体的小鼠能够抵抗各种因素引起的肺纤维化[5]。从表1可知，HyP和TNF-α在肺损伤肺纤维化模型中表达明显，他汀组、黄芪组及联合组HyP和TNF-α表达水平均明显下降，特别是联合组下降更为明显(P<0.05)，说明黄芪联合阿托伐他汀对肺纤维化组织HyP和TNF-α具有明显的调节作用。

黏附分子是指存在于细胞表面，介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触与结合的一类膜表面糖蛋白，与白细胞穿过内皮细胞密切相关，主要包括ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。目前认为白细胞与内皮细胞紧密黏附是通过CD11/CD18-ICAM-1和VLA-4-VCAM-1两条通路实现。中性粒细胞与血管内皮细胞紧密黏附以前者为主。在炎症介质作用下，中性粒细胞上调表达CD11/CD18，内皮细胞上ICAM-1表达增强，从而使中性粒细胞通过CD11/CD18-ICAM-1通路不可逆的黏附到内皮下。在组织中趋化因子作用下，穿内皮细胞间隙到达炎症区域，沿趋化因子梯度移行至细胞外基质，最终白细胞经基底膜与假复层柱状上皮进人气道腔内。其中在内皮细胞连接处表达的PECAM-1介导这一过程。一旦中性粒细胞与肺泡内皮、上皮或者与间质中的细胞外基质蛋白接触，细胞内的毒性物质如各种蛋白酶、氧自由基和细胞因子外诱捕网等物质会被释放出来，损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮，最终导致ALI。同时单核细胞黏附与移行通过上述两条通路均可进行，VLA-4-VCAM-1可作为CD11/CD18-ICAM-1的替代途径。单核吞噬细胞聚集，其细胞毒作用增强，加重肺损伤[6]。随后肺损伤修复，间质胶原增生，最终导致肺纤维化。同时氧化应激或氧化信号也可能加重肺纤维化[7]。本研究可以看出，急性肺损伤肺纤维化各组ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1明显增强(P<0.05)，细胞黏附功能活跃，而使用阿托伐他汀和黄芪干预后其表达水平明显下降，特别是联合组下降更为明显(P<0.05)，说明黄芪联合阿托伐他汀对肺纤维化组织细胞黏附功能具有明显的调节作用。

阿托伐他汀为常用的抗血脂药物，其抗肺损伤肺纤维化的机制主要有：①通过抗脂质氧化保护作用来抑制炎性介质释放，降低氧化应激，减轻肺组织炎性反应[8]；②改善内皮功能，抑制血管平滑肌的增殖和迁移，促进炎症吸收[9]；③抑制黏附分子表达，减少单核-巨噬细胞的黏附和分泌功能，减轻动脉壁巨噬细胞和泡沫细胞的形成等[10]。同时研究证实黄芪具有明显的抗缺氧、抗炎、镇痛和调节免疫的功能，并能通过调节细胞黏附分子表达、改善血管内皮等作用改善肺纤维化[1]。本研究表明黄芪联合阿托伐他汀钙能协同减轻肺损伤肺纤维化进程，其机制可能与其能降低HyP和TNF-α含量以及调节细胞黏附功能，减少白细胞的黏附以及与内皮细胞之间的相互作用，阻断白细胞穿过血管内皮游出到达炎症部位，减轻其随后释放的一系列细胞物质对肺泡及血管的损伤，从而抑制炎症反应达到抑制纤维化的效应有关。