异甘草素通过JAK/STAT途径治疗小鼠特应性皮炎的机制研究

李媛媛，潘新锋，池丽俏

(复旦大学附属中山医院青浦分院皮肤科，上海 201700)

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种常见的皮肤疾病，在婴儿和儿童中常见，临床上以慢性炎症为特征，组织学上以炎症细胞的皮肤浸润为特征[1]。局部类固醇治疗仍然是治疗AD的主要方法。然而，这种治疗与严重的副作用有关，包括萎缩、痤疮、白内障、生长迟缓和皮肤红烧等[2]。因此，需要寻找新的抗皮炎药物来应对这一挑战。异甘草素是从甘草中分离得到的重要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝、护心等多种药理特性[3]。研究显示，作为炎症反应的有效调节剂，异甘草素可抑制活化的人脐静脉内皮细胞上的血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表达，并减弱肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的血小板内皮细胞黏附分子1的表达[4]。在分子水平上，异甘草素通过阻止核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的核转运，在转录水平上消除了TNF-α诱导的VCAM-1积累[5]。然而，异甘草素对AD的作用研究较少。Janus激酶-信号转导和转录激活因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)是许多细胞因子和生长因子的经典信号转导途径，在免疫学通路中起放大效应和相互连接的作用，JAK-STAT抑制剂通过阻断JAK和STAT磷酸化，起到缓解AD的作用[6]。本研究检测异甘草素对小鼠AD的治疗效果，并探讨JAK-STAT途径在其中的作用，为异甘草素治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物:60只SPF级雄性C57BL/6小鼠购自国科赛赋河北医药技术有限公司，8周龄，体质量25～30g，动物生产许可证号：SCXK(冀)2019-0002，动物使用许可证号：SYXK(冀)2019-0004，动物质量合格证号：JL2020061302，实验动物饲养环境温度(22±2)℃，相对湿度为40～70%、噪音≤50dB，环境昼夜循环(12h/12h)的环境中自由进食和饮水，适应性喂养一周后进行。

1.2主要试剂与仪器:异甘草素(原料药，纯度≥98%，湖北远成赛创科技有限公司，批号：961-29-5)；醋酸泼尼松龙片(上海信谊药厂有限公司，批号：20200413)；2,4-二硝基氯苯(DNCB)(美国Sigma公司，批号：2508193)；白细胞介素-4(IL-4)、TNF-α和免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：ml6923215、ml692127、ml692248)；蛋白抽提试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR0103)；JAK1、JAK3、STAT3、STAT6和β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：SC-5217、SC-5517、SC-5264、SC-2154、SC-1007)；山羊抗鼠二抗(武汉艾美捷科技有限公司，批号：C5164)；HBS-1096B型酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；DYCZ-24KF型垂直电泳仪(上海熙浩实业有限公司)；GelDoc IT TS2型凝胶成像仪(美国UVP公司)。

1.3分组、造模及给药:将60只小鼠按随机数表法分为阴性对照组、模型组、异甘草素低剂量组、异甘草素高剂量组和阳性对照组，每组12只。参照文献[7]的方法进行特应性皮炎小鼠造模：实验前1d去除小鼠背部毛发(面积2cm×3cm)，实验第1～3天，除阴性对照组小鼠，其余各组小鼠每天用100μL 1% DNCB涂于小鼠背部脱毛区及双耳部，第4d开始改为隔天涂抹一次，直到第28天，小鼠背部出现脱屑、红斑等情况则表示造模成功，48只小鼠均造模成功。阴性对照组小鼠用100μL生理盐水涂抹。造模成功后第1天，异甘草素低剂量组、异甘草素高剂量组小鼠分别灌胃50mg/kg、100mg/kg的异甘草素[8](异甘草素溶于蒸馏水，配制成浓度分别为10mg/mL、20mg/mL的溶液)；阳性对照组小鼠灌胃10mg/kg的泼尼松龙[9](泼尼松龙溶于蒸馏水，配制成浓度为1mg/mL的溶液)；阴性对照组和模型组灌胃等量蒸馏水；各组灌胃体积均为10mL/kg，每天1次，连续给药14d

1.4小鼠抓挠行为评价:末次给药后，把小鼠放在笼子里，适应15min，记录10min内抓挠行为的次数，本实验将抓挠行为定义为后爪运动，记录用后爪抓鼻、耳和背侧皮肤，所有评估均以盲法进行。

1.5小鼠皮炎评分[9]:做完抓挠行为评价后，观察各组小鼠背部皮损大体表现，评估小鼠背部皮肤皮炎的严重程度，四种症状(红斑/出血、水肿、剥蚀/糜烂、瘢痕/干燥)，每种症状的严重程度分别为0(无)、1(轻度)、2(中度)、3(重度)。皮炎的总评分(表示严重程度)定义为所有评分的总和，评分区间为0～12分。

1.6血清中IL-4、TNF-α和IgE水平检测:小鼠眼球取血，3000×g离心5min，分离血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-4、TNF-α和IgE含量。

1.7皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平检测:取一块致敏部位的皮肤组织，分别进行研碎，加入相应蛋白抽提试剂，冰浴2h，3000×g离心取上清，进行电泳(30μg/孔)，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1h，将膜与JAK1(1∶200)、JAK3(1∶200)、STAT3(1∶400)、STAT6(1∶300)和β-actin(1∶1000)抗体进行孵育，4℃过夜，将山羊抗鼠二抗(1∶5000)在室温下孵育30min。进行显色，结果用Quantitive软件分析，以β-actin作为内对照。

2 结 果

2.1各组小鼠皮损表现:实验结束时，阴性对照组小鼠皮肤正常；模型组小鼠皮肤出现不同程度的红斑、干燥、抓痕、表皮糜烂脱落，结痂；异甘草素低、高剂量组症状明显减轻，异甘草素高剂量组疗效明显；阳性对照组疗效较异甘草素高剂量组好。见图1。

2.2各组小鼠抓挠次数和皮炎评分的比较:与阴性对照组相比，其余各组小鼠抓挠次数和皮炎评分增加(P<0.05)；与模型组相比，异甘草素低剂量组、异甘草素高剂量组和阳性对照组小鼠抓挠次数和皮炎评分降低，异甘草素各剂量组呈剂量依赖性，但效果不如阳性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠抓挠次数和皮炎评分的比较

2.3各组小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平比较:与阴性对照组相比，其余各组小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平增加；与模型组相比，异甘草素低剂量组、异甘草素高剂量组和阳性对照组小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平降低，异甘草素各剂量组呈剂量依赖性，但效果不如阳性对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清中IL-4 TNF-α和IgE水平比较

2.4各组小鼠皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平比较:与阴性对照组相比，其余各组小鼠皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平增加(P<0.05)；与模型组相比，异甘草素低剂量组、异甘草素高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平降低，异甘草素各剂量组呈剂量依赖性，但效果不如阳性对照组(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组小鼠皮肤组织中JAK1 JAK3 STAT3和STAT6蛋白水平比较

图2 各组小鼠皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白印迹图

3 讨 论

AD是一种常见的炎症性皮肤病，以湿疹和抓挠行为为特征，可引起皮肤损伤。虽然泼尼松龙是治疗炎症性疾病(包括接触性皮炎和AD)最有效的类固醇药物之一，但可能会产生严重的副作用[10]。各种实验和临床研究表明，从草药提取物或衍生物中提取的天然免疫调节剂可能对AD有治疗作用。异甘草素是从甘草中提取的小酚类生物活性分子，对炎性疾病和心血管疾病具有多种药理活性[11]。在本研究中，我们检测了异甘草素在DNCB诱导的AD小鼠模型中的作用。结果表明，异甘草素可以改善AD症状，表现为抓挠行为次数减少和皮炎评分降低。虽然异甘草素改善程度不如泼尼松龙，但考虑到泼尼松龙的副作用，异甘草素还是有进一步研究的价值。

血清IL-4、TNF-α和IgE的过度表达是过敏性疾病(包括哮喘和AD)的标志。IL-4有助于从原始T细胞扩增Th2细胞亚群，并促进B细胞的同种型转换，以产生针对特定环境变应原的IgE抗体。从幼稚T细胞向过敏性Th2细胞的转换中，IL-4也是必不可少的。TNF-α在下调抗原呈递细胞的白细胞介素-12(IL-12)产生中起作用，并促进幼稚Th0细胞向Th2谱的分化[12]。因此，我们检测了异甘草素是否抑制AD小鼠血清IgE。本研究结果显示，与模型组相比，异甘草素治疗后，血清中IL-4、TNF-α和IgE水平显著降低。由于AD是一种以Th2细胞增多为主的疾病，因此研究JAK-STAT通路如何调节Th2分化将有助于我们了解JAK-STAT在AD中可能发挥的作用。

JAK-STAT途径是皮肤病学领域中一个新兴的方向，研究表明，该途径可能与炎症性皮肤疾病有关，特别是关于牛皮癣、AD和黑色素瘤[13]。JAK-STAT途径对免疫系统的正常功能至关重要，在许多炎症和自身免疫性疾病的JAK-STAT途径被破坏。当配体与其受体的结合时导致JAK活化，进而激活STAT，然后激活的STAT易位到细胞核以调节其靶基因[14]。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2(TYK2)，STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A/B和STAT6。IL-4是Th2细胞分化和细胞因子产生所必需的，在AD的发生中，IL-4通过JAK-STAT途径导致Th1/Th2的失衡，其中STAT6是调节IL-4介导的免疫应答的关键转录因子，IL-4还可通过JAK1/3-STAT6募集嗜酸性粒细胞在皮下积聚等。此外，依赖JAK-STAT途径的细胞因子还有干扰素γ(IFN-γ)、TNF-α以及与Th2相关的细胞因子如白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)和白细胞介素-23(IL-23)等。上述细胞因子最终可以导致涉及JAK-STAT途径下游的Th2炎症因子增多，介导AD发生。在AD的小鼠模型中，B细胞大量产生IgE和过度的炎症反应归因于B细胞中JAK3的强烈磷酸化[15]。泛JAK抑制剂Pyridone 6(P6)延迟了AD小鼠的发作并减轻了AD皮肤损害的严重性，P6抑制TNF-α/STAT3和IL-4/STAT6途径。本研究结果显示，异甘草素能降低小鼠致敏部位皮肤组织中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平，说明它能抑制JAK-STAT途径，与上述讨论一致。

综上所述，异甘草素可改善AD小鼠皮损，降低血清IL-4、TNF-α和IgE水平，它的这些抗特应性作用可能是通过抑制JAK-STAT途径来介导，为AD的治疗提供了新的策略。