基于网络药理学红花三味散治疗非酒精性脂肪肝病的作用机制*

阿润，王秀兰，策力木格，王徽

(内蒙古民族大学蒙医药学院，通辽 028000)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由于三酰甘油在肝细胞内大量聚集引起的慢性肝病，可发展成肝硬化或肝癌[1]。全球流行病学调查表明，普通成人NAFLD患病率6.3%～45%，包括中国在内的亚洲多数国家NAFLD患病率处于中上水平[2]。NAFLD是现代医学病名，蒙医中没有完全匹配的病名。多数蒙医学者认为NAFLD属于“通拉嘎未消化症”的范围，蒙医治疗该病时以调理体素，平衡“三根”，清热解毒，清“肝希拉热”，祛“巴达干希拉”，抑制“赫依”增生为原则，针对各种类辨证施治[3]。

蒙药红花三味散由红花、栀子、菊花三味药组成，具有清血热、清肝热和保肝利胆功效，主要用于肝损伤和脂肪肝[4]。始载于《甘露四部》[5]，其中菊花和栀子为国家卫生健康委员会认定的药食同源药材，红花既是中医蒙医常用药材，也可作为保健食品。前期实验研究表明，红花三味散对D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤大鼠具有显著的保护作用，其保肝作用机制可能与抑制氧化应激、炎症反应有关[4]。由于红花三味散具有多成分、多靶点、多途径的协同作用等特点，其有效成分的作用靶点及分子机制目前尚不清楚。网络药理学突破了传统“单靶点、单途径”的研究理念，从整体性、系统性的角度研究中药及复方的成分、靶点、疾病之间的网络关系，为阐明民族医药科学内涵提供了新的思路与方法[6]。因此，笔者借助网络药理学的思路，探讨红花三味散治疗NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验用软件及在线工具本文研究需要使用较多软件及在线工具，如活性成分筛选时利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，化合物靶标预测时使用STITCH和Swiss Target Prediction，利用在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和DisGeNET分别进行NAFLD发病机制靶标的预测，在绘制网络拓扑图时需要安装Cytoscape软件，详细内容见表1。

表1 本文研究使用的软件及在线工具

1.2红花三味散中活性成分的筛选通过检索TCMSP分别收集红花、栀子和菊花中主要的化学成分，按照化学成分的口服生物利用度[oral bioavailability(OB)>30%]、类药性[drug-likeness(DL)>0.18]的化学成分作为候选活性成分。

1.3红花三味散化合物的靶标预测将化合物导入PubChem中得到化合物的SMILE格式和2D structure，依据化合物相似性搜索和反向分子对接的方法采用STITCH、Swiss Target Prediction和TCMSP等网站预测化合物靶标。对以上3个数据库的预测结果汇总、去重，整理收集到的靶点导入Uniprot数据库，将所有靶基因名称校正为其官方名称(official gene symbol)，作为红花三味散化合物的预测靶标。

1.4构建红花三味散活性成分-作用靶点的网络根据红花三味散中主要有效成分预测的靶点，建立活性成分-作用靶点之间的相互对应关系。将活性成分和作用靶点作为网络中的节点(node)，两者之间的相互作用作为网络中的连接(edge)，制成Excel表格，导入Cytoscape软件中，运用插件Network Analyzer计算网络特征。

1.5NAFLD相关基因的收集从OMIM和DisGeNET数据库中通过检索关键词“non-alcoholic fatty liver disease” “nonalcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”收集疾病相关靶点，整理后建立NAFLD相关靶点数据集。通过红花三味散活性成分靶点和NAFLD靶点匹配，得到红花三味散治疗NAFLD的潜在靶点。

1.6蛋白质-蛋白质互作网络的构建String数据库是一种包含已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。将红花三味散的关注靶点导入String数据库，获取蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用网络图。

1.7生物学功能和信号通路注释分析将关注基因导入DAVID数据库，进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，并用错误发现率(false discovery rate，FDR)错误控制法(FDR<0.05)对P值作检验校正，最终设定阈值P<0.05，筛选差异有统计学意义的生物过程[7]，利用OmicShare绘图。

1.8网络构建采用Cytoscape软件的Merge功能构建成分-靶点-通路网络模型。网络中每个节点的拓扑学用度数(degree)和接近中心(central)度进行评估。节点度数和接近中心度由Cytoscape插件Network Analyzer进行分析。

2 结果

2.1红花三味散中活性成分的筛选在TCMSP数据库里对其ADME性质进行评价，分别筛选得到红花化学成分22种、栀子化学成分15种、菊花化学成分20种。其中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇为三味药共有成分，豆甾醇为红花及栀子共有成分，γ-谷甾醇和木犀草素为红花及菊花共有成分，鲨烯为栀子及菊花共有成分。所有活性化合物经去重后得到47种，基本信息见表 2。

表2 红花三味散中的活性成分

2.2活性成分-靶点网络构建与分析使用Cytoscape软件将47种化合物与430个靶点构成化合物-靶点网络。化合物-靶点网络总共包括477个节点和1458条边。其中，红色节点代表红花化合物，绿色节点代表菊花化合物，蓝色节点代表栀子化合物，浅蓝色节点代表化合物对应的潜在靶点，每条边则表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系(图 1)。Degree的大小代表网络中的关键度，槲皮素的作用靶点最多(degree>170)，其次是山奈酚(degree>82)、木犀草素(degree>77)、异鼠李素(degree>56)及黄芩苷元(degree>53)等。由此得知同一个活性成分作用于多个靶点，且这些具有多靶点的活性成分可能是药理作用的核心点，这体现了红花三味散多成分、多靶点的协同作用特点。

红色代表红花药材化学成分；绿色代表栀子药材化学成分；深蓝色代表菊花药材化学成分；黄色代表2种药材或3种药材共同成分；浅蓝色代表靶点。

2.3潜在靶点的预测从DesGeNET和OMIM数据库中收集到的227个NAFLD疾病相关的基因与活性成分的430个基因相映射，筛选出了42个红花三味散治疗NAFLD的潜在靶点，具体信息见表3。

表3 红花三味散活性成分的潜在靶点信息

2.4蛋白质-蛋白质互作网络分析将上述42个潜在靶点导入String数据库中，限定物种为人，从而获得蛋白质相互作用关系，导入Cytoscape软件中构建蛋白质相互作用网络，见图2。图2中节点表示蛋白质，边表示蛋白质间的相互关联，共涉及39个节点，239条边。用节点的大小和颜色表示degree值的大小，节点越大对应的degree值越大，颜色由深红变淡粉对应degree值的大小。用边的粗细表示Combine score值的大小，颜色由深蓝变浅蓝对应Combine score值的大小。边越粗，颜色深蓝，边粗时Combine score值越大。在靶点中，度值最高的前5位是：INS(degree>32)、白细胞介素(IL)-6(degree>29)、肿瘤坏死因子(TNF)(degree>26)、JUN(degree>23)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)(degree>21)。

图2 蛋白质-蛋白质互作网络图

2.5潜在靶点的GO富集将红花三味散的关键靶点通过DAVID数据库进行GO富集分析，即从生物过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组分(cellular component)角度进行功能注释。GO富集分析结果(P<0.05，FDR<0.05)表明红花三味散在生物过程中与转录调控、药物结合、老化等相关性最大；在分子功能中与DNA结合和药物结合及类固醇激素受体活性相关性最大；在细胞组分中与质膜外侧面相关性最大。详细信息见图3。

图3 GO富集分析

2.6KEGG通路分析将红花三味散的42个关注基因富集在KEGG通路时，富集结果(P<0.05，FDR<0.05)得到与NAFLD关联度最高的13条相关通路，分别为PPAR信号通路、胰岛素抵抗通路、NAFLD通路、乙型肝炎通路、南美锥虫病通路、癌症通路、炎症性肠病通路、利什曼病通路、破骨细胞分化通路、类风湿性关节炎通路、TNF信号通路、百日咳通路及MAPK信号通路。详细信息见图4。

图4 KEGG通路富集分析

2.7红花三味散的网络分析使用Cytoscape建立了红花三味散治疗NAFLD的“活性成分-靶点-通路网络图”，如图5所示，能直观地看到红花三味散的关键靶点分布于不同的信号通路，从不同角度揭示多成分-多靶点-多通路的相互协调的作用特点。选取与NAFLD密切相关的NAFLD通路、胰岛素抵抗通路和乙型肝炎通路，反向寻找了与这些通路相关的靶点、化合物及药材，并使用Cytoscape分析网络特征，观察化合物与靶点的作用情况以及靶点在生物通路中的分布情况。网络中介度和紧密度越高表示该靶点或化合物在生物网络系统中发挥重要作用[8]。通过网络分析发现INS、JUN、TNF、PPARA、RELA、IKBKB和IL-6等介度较高的7个靶点可能是红花三味散调控NAFLD、胰岛素抵抗和乙型肝炎三条通路的关键靶点，详细信息见图6、表4。红花三味散调控NAFLD通路的机制：在单纯性脂肪肝(simple steatosis)通路中化合物槲皮素、山奈酚及木犀草素等活性成分有效地抑制IL-6、TNF及INS等靶点，从而降低高胰岛素血症的产生及新脂肪酸的合成；在非酒精性脂肪肝炎通路(non-alcoholic steatohepatitis)中，红花三味散的有效成分槲皮素、黄芩苷元、MOL002694等能够抑制TNF-α、CYP2E1、IL-1、IL-6、IKBKB、FAS及TGF-β1等靶点，拮抗脂肪肝炎形成、细胞死亡、炎症反应、肝脏纤维化及肝细胞损伤。

图5 活性成分-靶点-通路图

图6 NAFLD通路、胰岛素抵抗通路、乙型肝炎通路相关网络模型

表4 NAFLD通路、胰岛素抵抗通路和乙型肝炎通路网络拓扑学参数

3 讨论

蒙药是蒙医临床用于治疗和预防疾病的一种主要途径，也是蒙医药研究的热点之一。蒙医方剂由多味药灵活配伍而成，其多成分、多靶点既是蒙医药的特点，也是深入研究蒙药的难点及重点。网络药理学整合了化学、医学、生物数据、网络模拟方法，其多靶点、多途径、多层次的评价体系与策略，目前在中医药及民族医药的研究中有很大的预测作用[9]。网络药理学研究为探讨蒙药的作用机制及发现蒙药的潜在作用靶点提供了新途径。

本研究发现红花三味散治疗NAFLD的化合物以黄酮类化合物为主，拓扑学分析结果表明槲皮素的作用靶点最多，其次是山奈酚、木犀草素、异鼠李素、黄芩苷元。这些成分与NAFLD预测的核心靶标有高度相关性。红花药材中槲皮素、山奈酚及木犀草素的含量分别为0.197，0.394，1.45 μg·g-1[10-11]。栀子药材中西红花酸和京尼平龙胆双糖苷的含量分别为0.889，35.566 mg·g-1[12-13]。栀子药材中金合欢素、槲皮素、木犀草素、蒙花苷、二咖啡酰奎宁酸的含量分别为1.760，2.515，50.63 mg·g-1、0.301%和0.833 mg·g-1[14-17]。研究表明，槲皮素可以降低肝星状细胞活化，预防肝纤维化，通过抑制TGF-β1/Smads信号通路和激活PI3K/AKT信号通路，抑制肝纤维化引起的自噬，从而减轻肝损伤[18]。山奈酚对急性肝衰竭小鼠具有保护作用，其作用机制可能通过调控核因子-κB信号通路而减轻肝脏炎症反应[19]。木犀草素具有缓解乙醇所致的肝损伤的作用，其机制可能与降低自由基生成、减轻脂质过氧化有关[20]。异鼠李素对醋氨酚致人肝细胞的损伤具有拮抗作用，作用机制可能为提高细胞活性，改善受损细胞形态，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛含量，降低丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的释放量[21]。由此得知上述degree值大的化合物通过不同的作用机制发挥保肝作用。

通过KEGG信号通路分析发现，红花三味散治疗NAFLD主要通过调控胰岛素抵抗通路、NAFLD通路、PPAR信号通路、乙型肝炎通路、癌症通路、TNF信号通路及MAPK信号通路而实现。NAFLD发病机制尚不明确，临床研究发现几乎所有患者都有肝脏及周围组织胰岛素抵抗，其严重程度与NAFLD病情进展正相关[22]。周伟青等[23]研究发现茵陈蒿汤对NAFLD伴胰岛素抵抗大鼠具有保肝作用，其机制可能是调节脂肪因子水平、改善糖脂代谢紊乱，从而逆转肝细胞损伤有关。MAPK信号通路也是胰岛素抵抗信号转导途径之一，目前发现5种MAPK信号转导途径[24]。王昱[25]发现油橄榄叶提取物可通过调节TLR4-p38 MAPK信号通路缓解肝脏脂肪变性和炎症因子反应，抑制NAFLD的进展。PPAR对维持脂质代谢的平衡起着十分重要的调节作用。PPARα在肝脏高表达，它可通过调节与脂质代谢相关基因的表达，促进脂肪酸β氧化，并减少脂肪酸和三酰甘油的合成，从而减轻肝脏内脂质蓄积[26]。赵喜等[27]研究发现二苯乙烯经PPARα信号通路激活自噬从而治疗大鼠高脂性脂肪肝。由此可知红花三味散治疗NAFLD是通过直接或间接调控胰岛素抵抗信号通路、MAPK信号通路、PPAR信号通路和NAFLD通路等来实现。

本研究利用网络药理学方法初步预测了红花三味散治疗NAFLD的药效物质基础、核心靶点及可能的作用机制，为红花三味散的后续开发研究提供了新思路和方向，下一步课题组将结合分子生物学实验进行验证。