葛根素对噪声慢性应激大鼠行为学及脑内记忆相关蛋白表达的影响

葛剑，王勇，陈谦学，王龙

(1.武警湖北总队医院神经外科，武汉 430061；2.武汉大学人民医院神经外科，武汉 430060)

随着机械化的进程、生活环境的变化，人们越来越多地暴露于各种应激源的刺激中[1]。噪声被认为是当今社会三大公害之一，噪声应激对人和动物的神经行为都会产生不良影响[2-3]。在应激源的刺激下，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴会对应激进行适应性调节[4]，但人长期处于应激状态下或应激过于强烈则会造成学习和记忆障碍、抑郁，甚至出现神经、免疫功能紊乱[5-6]。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取并分离出来的一种单体，主要成分为4，7-二羟基8-β-D葡萄糖异黄酮，属异黄酮化合物。研究表明，葛根素对脑神经细胞有保护作用，可减少钙离子内流及阻断β受体，具有非内皮依赖性舒血管作用[7-8]，但其对噪声刺激下慢性应激性大鼠行为学及脑内记忆相关蛋白的影响笔者尚未见报道。本实验模拟生活中人们上下班高峰期暴露于噪声环境，于固定时间段采用交通类型噪声刺激建立慢性应激模型，探讨葛根素在噪声慢性应激大鼠行为学变化中的作用，为后续研究其潜在的药理机制提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物无特定病原体(SPF)级生长发育期SD大鼠，体质量174～273 g，平均200 g，购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2019-0004。受试鼠饲养于SPF级标准动物房内，12 h/12 h 昼夜循环照明，室温(20±3)℃，相对湿度50%～60%。

1.2药品与试剂一抗：β-actin[天德悦(北京)生物科技有限责任公司，批号：TDY051，5%脱脂牛奶1：10 000)，瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)(Abcam，批号：ab203103，5%脱脂牛奶1：500)，二抗：HRP-山羊抗兔(ASPEN，批号：AS1107，5%脱脂牛奶1：10 000)。酶联免疫试剂盒蛋白激酶C(protein kinase C，PKC，批号：120685-11-2，灵敏度10 pg·mL-1)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF，Abcam，批号：ab108319，灵敏度1.0 pg·mL-1)、磷酸化cAMP 反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB，Santa Cruz，批号：SC-7978，灵敏度0.1 ng·mL-1)购自上海源叶生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.3仪器与设备ELx800酶标仪(美国Bio-Tek)，蛋白电泳及转膜系统(美国Bio-Rad)，凝胶成像及分析系统(英国Syngene)，显微镜BX53(日本Olympus)，Morris 水迷宫软件(美国San Diego Instruments，Inc Smart 2.0)，Morris水迷宫为国产通用大鼠型，圆柱形制桶，直径150 cm，高50 cm，水深40 cm，平台为直径11 cm×高38 cm的圆形平台。

1.4动物分组及给药SD雄性大鼠 32只，按体质量随机分为正常对照组、模型对照组和葛根素小、大剂量组，每组8只。参照文献[9]，通过噪声连续刺激60 d建立慢性应激大鼠模型：葛根素大、小剂量组及模型对照组置于90 dB噪声场中，噪声类型为白、粉噪类交通噪音，每天6 h(上午7：00—9：00，中午11：00—13：00，下午17：00—19：00)规律性刺激，予以2个月噪声刺激，刺激同时给予正常喂养。正常对照组未做任何处理。造模结束后，对各组大鼠腹腔注射给药，葛根素小剂量组予以葛根素100 mg·kg-1，大剂量组予以葛根素200 mg·kg-1，均用0.9%氯化钠溶液配制成2 mL腹腔注射给药，正常对照组与模型对照组用等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射给药，每日1次，连续给药1周。

1.5测量指标及方法

1.5.1体质量变化实验过程中测定每只大鼠造模前及造模后第15，30，45天和给药后(水迷宫实验前)的体质量变化情况。

1.5.2蔗糖水消耗实验参考相关实验[10]：在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2瓶均装有1%蔗糖水，随后24 h，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯水。23 h禁食禁水后进行动物的基础蔗糖水/纯水消耗实验，同时给予每只大鼠事先定量并称量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水。1 h 后，取走2瓶并称定质量。计算动物的蔗糖水消耗(%)=蔗糖水消耗/总液体消耗×100%。分别于造模前、造模后第60天、给药后(水迷宫实验前)进行实验，计算蔗糖水消耗。

1.5.3水迷宫实验Morris水迷宫实验时水温保持(26±1)℃，室内安静。将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录大鼠找到水下平台的时间(s)。每只大鼠每天训练4次，两次训练之间间隔15～20 min，连续训练5 d。最后一次获得性训练结束后的第2天，将平台撤除，开始60 s的探查训练。将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录大鼠在目标象限所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。探查训练结束后的第2天，开始维持4 d的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。每天训练4次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。最后一次对位训练的第2天进行，方法与上述探查训练类似。记录大鼠60 s内在目标象限(平台第2次所在区)所花时间和进入该区的次数。水迷宫上方安置摄像机，用于同步记录大鼠游泳轨迹，训练期间水迷宫外参照物保持不变。

1.5.4TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF蛋白表达检测 免疫印迹法(Western blotting)检测实验鼠脑海马组织TRPV1蛋白的表达水平，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PKC、p-CREB、BDNF蛋白的表达水平。

2 结果

2.1葛根素对噪声引起的慢性应激大鼠体质量变化的影响见图1。各组大鼠在造模前体质量相近，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模期间4组大鼠的体质量逐渐增加，但与正常对照组比较，模型对照组和葛根素组大鼠体质量增加较缓慢；造模结束至葛根素给药第7 天，葛根素大、小剂量组体质量均大于模型对照组(t=3.455，4.230，P<0.01)。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。

2.2葛根素对噪声引起的慢性应激大鼠1%蔗糖水摄入量的影响 见图2。各组大鼠在造模前1%蔗糖水摄入量相近，差异无统计学意义(P>0.05)。给予噪声刺激60 d后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠的糖水摄入量逐渐下降(P<0.01)，表明模型对照组大鼠出现快感消失；经葛根素处理后，1%蔗糖水摄入量有一定提高。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。①与模型对照组比较，t=7.986，P<0.01；②与模型对照组比较，t=4.586，P<0.05。

2.3葛根素对噪声引起的慢性应激大鼠行为学指标的影响见图3。正常对照组大鼠游泳路径较为明确，主要集中在原平台所在象限，而模型对照组大鼠游泳路径大多出现在非平台象限。从图4可见，撤掉隐藏平台后(水迷宫实验第7 天)，与正常对照组比较，模型对照组大鼠在平台所在象限所停留的时间明显少于非平台象限(P<0.05，P<0.01)；经小剂量葛根素处理后，所在象限停留的时间明显上升(P<0.05)。模型对照组与正常对照组比较，在目标象限游泳总路程明显下降(P<0.05)。经小剂量葛根素处理后，大鼠在目标象限游泳总路程有所上升(P<0.05)。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。①与模型对照组比较，t=3.269，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.965，2.926，2.855，P<0.05。

2.4葛根素对噪声引起的慢性应激大鼠脑内记忆相关蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF表达的影响 见图5。与正常对照组比较，模型对照组大鼠的脑海马组织TRPV1蛋白表达水平显著上调(P<0.01)；与模型对照组比较，葛根素大、小剂量组TRPV1蛋白表达水平显著下调(P<0.01，P<0.05)。4组大鼠的脑海马组织PKC、p-CREB、BDNF表达水平的热图见图6，上述3种蛋白中，模型对照组PKC、p-CREB表达水平出现显著变化。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。①与模型对照组比较，t=24.050，27.740，P<0.01；②与模型对照组比较，t=7.623，P<0.05。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.葛根素小剂量组；D.葛根素大剂量组。紫色表示蛋白水平下调，红色表示上调，颜色强度表示蛋白表达的水平或趋势，数据表示为样本的平均值。

3 讨论

基于2012—2016年道路交通噪声监测数据，全国道路交通噪声污染呈不断恶化趋势[11]。《中国环境噪声污染防治报告(2016)》显示，2015年全国城市噪声污染仍较为严峻[12]。研究表明，人们在各种应激源的刺激中，噪声刺激的影响尤为突出，噪声的危害除了传统认识上的听力损伤，还有其他众多不良影响[13]。研究显示，环境噪音超过100 dB可影响血压[14]；人若长期处在噪声应激状态下或应激过于强烈则会造成空间学习和记忆能力障碍[15]。本研究发现，噪声引起的慢性应激大鼠的学习记忆能力受到了较显著影响，而小剂量(100 mg·kg-1)葛根素可部分改善噪声引起的慢性应激大鼠的空间学习记忆能力，葛根素的这一作用可能与脑海马组织的记忆相关蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表达水平相关。

在本研究中，经噪音刺激60 d期间，模型对照组大鼠体质量随噪声刺激时间加长出现增长缓慢，其糖水消耗量也逐渐降低，表明大鼠对食物的愉快感随之降低。模型对照组在水迷宫实验中逃避潜伏期明显延长，在原有平台象限游泳总路程明显下降，表明噪声刺激下慢性应激大鼠模型制备成功，且该模型大鼠的行为能力明显下降。给予葛根素腹腔注射后，大鼠体质量增加，糖水消耗上升，且其在水迷宫中逃避潜伏期明显缩短，在原有平台象限游泳总路程明显增加，且小剂量组与模型对照组之间实验数据差异有统计学意义，说明葛根素可以部分改善噪声刺激下慢性应激大鼠的空间学习和记忆能力，且小剂量作用效果更显著，这与余玉玲等[16]发现小剂量葛根素有效降低D-半乳糖模型大鼠嗅球内tau 蛋白磷酸化水平的结果相一致。

本研究结果表明，模型对照组大鼠脑海马组织的TRPV1、PKC表达显著上调，p-CREB、BDNF表达显著下调，而且葛根素小剂量组TRPV1、PKC表达显著下调，p-CREB、BDNF表达显著上调，提示葛根素改善噪声刺激下慢性应激大鼠的行为学能力，或与脑海马组织的记忆相关蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表达水平相关。TRPV1作为钙离子(Ca2+)通道广泛分布于神经系统，PKC是G蛋白耦联受体的效应器，在Ca2+信号转导级联反应中发挥着重要作用[17]。BDNF和p-CREB是核内转录因子介导的两种重要的神经保护蛋白，它们的表达水平可以反映神经元抵抗细胞损伤的能力[18]。上述多功能蛋白可调节生化反应，并且参与神经系统功能的调控。研究表明，葛根素可减少Ca2+内流及阻断β受体作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴[7-8]；此外，WU等[19]证实葛根素通过抑制TRPV1、降钙素基因相关肽和P物质预防紫杉醇诱导的大鼠周围神经病理性疼痛。以上结果提示，Ca2+信号通路可能参与了葛根素的神经保护作用，其分子机制还有待进一步研究。