鼠伤寒沙门菌新型转录因子STM0859的基因克隆、分子特征及其遗传进化分析

马忠梅，宁程程，郭 蕴，季春晖，孟庆玲，乔 军*，张星星，才学鹏

(1. 石河子大学动物科技学院, 新疆 石河子 832003; 2. 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所, 新疆 石河子 832000; 3. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 甘肃 兰州 730046)

【研究意义】鼠伤寒沙门菌(SalmonellaentericasubspeciesentericaserovarTyphimurium，ST)属于肠杆菌科的革兰氏阴性[1]、杆状及兼性厌氧菌[2]，是一种重要的人兽共患病原菌之一[3]。ST广泛存在于自然界，可在污水、动物排泄物和土壤中长期存活[4]。同时，ST可以感染在多种家禽和家畜，并且通过动物源性食品引起人类感染，导致食物中毒。此外，该菌在不利的环境中易形成生物被膜，可增强该菌对化学物质、应激(紫外辐射、渗透压和干燥等)、抗生素和宿主免疫系统具有较强的抵抗力[5]，给该菌引起相关疾病的防控带来巨大的挑战。【前人研究进展】大量的研究表明，ST可在多种毒力因子的参与下感染多种宿主，其完成侵染、胞内生存、繁殖和致病等生活过程需要多种调控因子的协同作用[6]。研究发现，LysR型转录因子家族在细菌群体感应、毒力、细菌耐药性、生物被膜形成和细胞分裂的调控相关，但LysR转录调节因子在鼠伤寒沙门菌调控功能暂不清楚[7]。【本研究切入点】STM0859基因属于LysR家族的转录调节因子，然而，STM0859具体的生物学功能尚不清楚。【拟解决的关键问题】为探究STM0859基因的功能，本研究对鼠伤寒沙门菌SL1344菌株STM0859基因进行克隆、编码蛋白分子特征和遗传进化分析，为进一步探讨STM0859对ST生长特性、环境应激、耐药性和毒力的调控作用奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂

ST SL1344强毒株和大肠杆菌(E.coli)DH5α由石河子大学预防兽医学实验室保存。LB肉汤琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限公司；DL-2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)载体购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自诺维森生物公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank登录的STM0859基因序列(登录号：FQ312003.1)设计扩增STM0859基因上游引物STM0859F5′-GGAATTCATGCACTTTGATATAAAAG ATTTA-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物STM0859R5′-CCTCGAGTCACTCAGTCTGAGCT GTGAG-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)，由北京华大基因公司合成。

1.3 ST STM0859基因的扩增、克隆及测序

挑取ST-SL1344单菌落于LB培养基中，置于37 ℃水平摇床培养15 h，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取ST-SL1344分离株基因DNA，以DNA为模板，分别以STM0859F和STM0859R为引物PCR 扩增出STM0859基因，PCR的反应体系为：H2O 7 μl，PCR Mixture 10 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl。反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物用1 %琼脂糖凝胶在0.5×TBE电泳缓冲液中进行电泳，与Marker DL-2000相比，将目的片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，并与pMD19-T(simple)载体4 ℃连接，转化DH5α感受态细胞，通过PCR筛选阳性菌克隆，送至华大基因公司测序。

1.4 STM0859基因及其编码蛋白质的分子特征分析

利用ProtParam在线软件( http://web.expasy.org/protparam/)计算蛋白质的理论分子质量、理论等电点；通过Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白质的亲水性与疏水性；利用PrositeScan(https://prosite.expasy.org/prosite.html)分析蛋白的结构域；通过SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白质的信号肽预测；利用DNAStar软件预测STM0859蛋白的二级结构，应用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质的三级结构。

1.5 STM0859基因核苷酸序列遗传进化分析

将ST-SL1344STM0859基因与GenBank已知的10多株ST不同菌株及其他种属细菌的LysR家族转录调节基因核苷酸序列进行对比，应用MEGA5.0软件对STM0859基因核苷酸序列进行遗传进化分析，并采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 STM0859基因的扩增、克隆及测序

用STM0859F与STM0859R引物扩增STM0859基因，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测得到约891 bp的目的条带(图1)。PCR产物与pMD19-T(simple)载体连接，转化到DH5α后通过菌液PCR筛选阳性克隆(图2)，对阳性克隆进行测序分析，结果显该基因与GenBank中预期的STSTM0859基因片段大小一致。

2.2 STM0859基因核苷酸及编码氨基酸序列分析

由图3测序结果显示，ST-SL1344STM0859基因全长891 bp，编码296个氨基酸；通过Motif Scan 在线软件分析发现含1个N-糖基化位点(151aa～154aa); 6个酪蛋白激酶II磷酸化位点(61aa～64aa,137aa～140aa,171aa～174aa, 184aa～187aa,>195aa～198aa,257aa～260aa);6个蛋白激酶C磷酸化位点(35aa～37aa, 53aa～55aa,65aa～67aa，164aa～166aa，266aa～268aa，284aa ～286aa); 5个N-豆蔻酰化位点(23aa～28aa,56aa～61aa, 146aa～151aa,224aa～229aa);1个酪氨酸激酶磷酸化位点：(22aa～28aa); 1个LysR家族底物结合域(90aa～293aa)1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH结构域(5aa～64aa)1个Orn/Lys/Arg脱羧酶C-末端结构域(21aa～83aa)。

2.3 STM0859蛋白分子特征分析

在线软件分析发现，ST-SL1344株STM0859基因编码蛋白分子量为33.6 kDa，等电点为7.83，其中Leu (L)含量最丰富(11.1 %)。疏水性平均数为-0.074，为亲水性蛋白。SignalP 4.0 Server分析显示，STM0859蛋白无信号肽序列；TMHMM 2.0 Server分析显示，STM0859蛋白不存在跨膜区。与大肠杆菌和不动杆菌LysR家族转录调控因子相比，三者在其N端均具有1个H-T-H超二级结构域(图4)，在C端有1个PBP2配体结合域，不动杆菌在N端还具有一个RbcR结构域，提示不同的细菌LysR家族蛋白成员在分子特征上存在一定的差异。

2.4 STM0859蛋白的高级结构分析

高级结构分析表明，STM0859含有α-螺旋(54.05 %)、β-折叠(6.76 %)无规则卷曲(21.28 %)和延伸链(17.91 %)组成。SWISS-MODEL预测该蛋白含有2个α-螺旋和2个β-折叠，形成了螺旋-转角-螺旋结构域 (图5～6)。

2.5 STM0859基因序列的遗传进化分析

与GenBank上18株不同来源的细菌LysR家族相应的同源基因相比，ST SL1344株与ST 14028S亲缘性最高，位于同一小分支；与肠道沙门氏菌肠道亚种PNCS009887、PNCS01484、CVM N26626及SC-B671株亲缘性相对较近，但与R8-34041和ST1141等株亲缘性较远；与鸡肠炎血清型str.287/911株、大肠杆菌str.K-12亚群MG 1655株、沙雷氏菌 AS13株亲缘关系最远，位于不同的分支上(图7)，提示STM0859基因在ST菌株间具有高度的保守性，在属间具有相对保守性。

3 讨 论

ST是一种重要的食源性人兽共患菌，该菌可通过巨噬细胞吞噬进入宿主细胞，并在胞浆内寄生的革兰氏阴性菌。该菌在完成吞噬小体逃逸、胞内生存、繁殖和细胞间扩散过程中需要多种毒力因子和转录因子的参与。转录因子(Transcription，TF)是一类能够结合在特定基因上游特异核苷酸序列上的蛋白，并能调控该基因的转录。转录因子在分子结构上通常含有DNA结合结构域(DBD)、效应结构域(TAD)与配体结合域(LBD)等[8]。研究发现，LysR家族蛋白含有上述结构域，属于转录因子，可调控许多病原微生物的基因表达。然而，LysR家族成员众多，其特定的生物学功能需要深入研究[9]。

现有的研究发现，LysR一般由约300个氨基酸组成，N端都包含一个螺旋-转角-螺旋基序，构成保守的DNA结合结构域[10-11],C端则为相对变异的协同因子作用区域，大部分LysR家族成员的该区域可结合一个来自于环境或代谢产生的小分子诱导剂或阻遏物，从而激活或抑制目标基因表达。本研究显示，STM0859属于LysR家族成员。有研究显示，LysR家族蛋白在不同的培养基和不同培养环境中表达量差异显著，可能与细菌能量代谢、环境应激、耐药性和毒力的调控相关。在大肠杆菌中，K-12 LTTRs调节氮源利用、氨基酸生物合成和分解代谢、氧化应激反应和细胞解毒[12-13]。BenM和CatM LTTRs可影响不动杆菌ADP1菌株芳香族化合物的降解[14-15]。鼠疫耶尔森菌的RovM、铜绿假单胞菌PA14的MvfR和霍乱弧菌的AphB均与毒力有关[16-19]。 Sheehan 等(2015)研究布鲁氏菌LysR家族成员VtlR转录调节因子发现，VtlR控制流产布鲁氏菌小RNA编码基因abcR2的表达，而流产布鲁氏菌的野生型毒力需要两个小RNA，AbcR1和AbcR2，表明LysR转录调节因子在布鲁氏菌中与其毒力调控有关。Manman 等(2019)研究恶臭假单胞菌菌LysR家族成员GcdR发现，GcdR通过抑制谷胱甘肽羟基化途径中2个关键基因csiD和lhgO的转录，激活谷胱甘肽coa脱氢途径中两个关键基因gcdH和gcoT的转录，调节谷胱甘肽的分解代谢反应。Fu等(2019)利用western blot和基因缺失技术证实LysR家族蛋白在抗药性治疗后在嗜水气单胞菌中表达下调，提示LysR家族成员参与了细菌耐药性的调控作用。

目前，鼠伤寒沙门菌STM0859的生物学功能尚不清楚。本研究首次克隆了ST SL1344强毒株转录因子STM0859基因，并对其分子结构特征进行分析，证实STM0859属于LysR家族转录调节因子。同源性分析显示，ST SL1344株STM0859基因与ST-14028S、ST-FDAARGOS_317、ST-TW-Stm6等菌株同源性很高，表明该基因在ST菌株间高度保守。与肠炎沙门氏菌亚种、鸡肠炎血清型str.287/91与大肠杆菌str.K-12亚群MG1655亲缘关系较远。STM0859蛋白含有螺旋-转角-螺旋结构域，推测其可与ST某些基因的顺式作用元件DNA序列结合而发挥调控作用，为深入研究该蛋白在ST能量代谢、环境应激、耐药性和毒力的调控作用奠定了前期基础。

4 结 论

通过对鼠伤寒沙门菌STM0859基因生物信息学分析，其属于LysR家族，该家族蛋白与细菌能量代谢、环境应激、耐药性和毒力的调控相关，因此STM0859基因可能参与了ST毒力、环境应激等过程，STM0859基因在ST菌株间具有高度的保守性，在属间具有相对保守性。研究结果为深入研究该蛋白在ST能量代谢、环境应激、耐药性和毒力的调控作用奠定了前期基础。