云南地区不同基因型蜡梅花香气成分分析

钱晓慧，陈龙清, 2，李 彪，施 蕊,2*

(1.西南林业大学园林园艺学院，云南 昆明 650224；2.云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650224；3.云南林业职业技术学院，云南 昆明 650224)

蜡梅(ChimonanthuspraecoxL.)为蜡梅科蜡梅属落叶灌木，是中国特有的冬季观花优良树种，也是珍贵的香料和药用植物，其活性成分具有抑制病原菌、抗氧化等功效[1]。【研究意义】花香作为蜡梅的典型特征之一，从中筛选出花香优良的品种，运用在其他产生较少挥发性化合物的开花植物的花香基因改造中具有潜在价值[2]。花香不仅作用于植物间的交流、繁殖和自我保护[3-4]，还能刺激人类的嗅觉细胞产生愉悦感。花香不仅在植物生长繁殖中起到关键作用，还被广泛运用到香水、香精、化妆品和药物中[5]，而蜡梅作为中国著名的传统冬季香花植物被广泛研究。【前人研究进展】Li等[6]研究发现花香的释放与蜜腺的分布有关；陆安霞等[7]结合感官审评与GC-MS分析发现全开状态的蜡梅花采摘后离体摊放20 h内能较好地保持花香的鲜灵度和浓郁度，且在12 ～ 20 h挥发性物质种类丰富。周继荣等[8]研究了蜡梅4个品种不同开花期的香气成分，认为在花茶生产中适宜选择内被片紫色条纹较少的素心和乔种品种，且盛开的蜡梅鲜花。此外，由于利用多元统计处理数据具有可使分析结果更加客观等优点，被渐渐运用到香气分析中，李卫芳等[9]用聚类分析将12个具代表性的汉中仙毫分为3类，并通过主成分分析建立了香气质量评价模型；李瑞等[10]根据香气物质的组成和质量分数，并运用主成分分析将蜜脆苹果归于酯香型苹果的乙醇酯型品种；郝丽宁等[11]利用主成分分析和聚类分析评价黄瓜果实的香气物质组成，发现不同基因型黄瓜香气物质种类、含量的差异是导致果实的风味差异的原因。史卫东等[12]用主成分分析和聚类分析法对菜心和芥蓝资源的表型多样性进行综合评价，这为挖掘和利用优异蔬菜种质资源提供参考。【本研究切入点】目前尚未对云南地区不同基因型蜡梅花香气成分进行差异研究，并且大部分集中于蜡梅种质资源调查[13-15]、叶片的挥发油以及提取物的生物活性研究[16-19]。【拟解决的关键问题】通过将花香结合蜡梅的表型性状研究，可为云南地区蜡梅的品种优选和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

依据表型差异选取云南地区8个不同基因型蜡梅品种(表1、图1)，样品采自位于云南省昆明市的西南林业大学(品种编号开头为XL)和黑龙潭公园(品种编号开头为HLT)。

1.2 试验方法

采摘蜡梅花于25 mL顶空进样瓶中，用手动压接机(Cat.#23398，20 mm，made in USA)按压铝盖扣住硅胶垫密封。送入自动顶空进样仪(美国赛默飞世尔公司)，45 ℃下预热并平衡30 min后取样进行GC/MS(美国赛默飞世尔公司TRACE GCULTRA ITQ 900气相色谱—质谱联用仪)分析，分流进样，分流比15∶1。

色谱柱为Inert Cap 5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；色谱条件：进样口温度250 ℃；柱温起始温度50 ℃，保持5 min，3 ℃·min-1升温到60 ℃，保持15 min；2 ℃·min-1升温到80 ℃，保持3 min；4 ℃·min-1升温到120 ℃。载气He (99.999%)，柱流量1 mL·min-1。质谱条件：电离方式EI，电子能量70e V，离子源温度200 ℃，接口温度260 ℃。扫描质量50～650 amu。

表1 蜡梅表型性状

然后经计算机谱库(NIST MS Search)检索，确定各组分，运用峰面积归一法，得出各组分相对含量。

1.3 数据统计与分析

利用SPSS Statistic 20.0 软件对蜡梅花各类花香成分物质进行主成分分析和聚类分析，比较各类成分对蜡梅花香的贡献及各类基因型蜡梅的综合品质。

2 结果与分析

2.1 不同基因型蜡梅花表型性状

试材中花型为喇叭型的有2种，荷花型3种，盘蝶形1种，钟型1种，磬口型1种；花径最大为2.37 cm×2.58 cm，最小为1.12 cm×1.27 cm；花被片数最多的为24片，最少为20片；中被片形状为椭圆形的有6种，阔卵形1种，长条形1种；中被片边缘波皱的有3种，内扣5种，平展1种；红心条纹4种、素心3种、晕心条纹1种。

2.2 不同基因型蜡梅花挥发性成分分析

8个基因型蜡梅花主要成分明显不同，经计算机谱库检索以及相关文献查阅[20-21]鉴定出各品种间成分不同，如图2和表2所示。

从离子图中看出，每个品种都含有罗勒烯(一种无环单萜类，有α、cis-β和 trans-β型)，而且相对含量很高，但是罗勒烯易氧化而形成同分异构体物质，所以8个基因型蜡梅的罗勒烯类型不统一；HLT015和HLT016与其他相比，2,4-已二烯对这2种蜡梅花整体香味的贡献率比较高，而乙酸苄酯对HLT016整体香味的贡献率比较低，对HLT015无贡献。罗勒烯是甜香，(E) -β-罗勒烯却是青草香味，而α-罗勒烯却是果香、花香[22]；乙酸苄酯具有水果香味并带有茉莉香气[23]，这可能是造成8个基因型蜡梅花香味不一的原因。

表2 蜡梅盛开期香气成分及相对含量

续表2 Continued table 2

8个基因型蜡梅中共同含有的挥发物质主要为(-)-α-蒎烯、罗勒烯、氧化芳樟醇、桃金娘烯醇、苯甲醇、水杨酸甲酯8种。从XL003中共鉴定出27种香气成分，主要为α-罗勒烯(43.64 %)、乙酸苄酯(34.63 %)、苯甲醇(7.59 %)和丁香酚(5.56 %)；从XL002中共鉴定出29种香气成分，主要为罗勒烯(44.41 %)和乙酸苄酯(26.53 %)；从HLT015中共鉴定出36种香气成分，主要为α-罗勒烯(75.87 %)和苯甲醇(6.03 %)；从HLT016中共鉴定出36种香气成分，主要为(E)-β-罗勒烯(68.23 %)苯甲醇(11.56 %)和乙酸苄酯(1.63 %)；从HLT017中共鉴定出33种香气成分，主要为(E)-β-罗勒烯(41.55 %)、乙酸苄酯(33.6 %)、苯甲醇(14.41 %)和丁香酚(1.84 %)；从HLT040中共鉴定出33种香气成分，主要为α-罗勒烯(35.58 %)、乙酸苄酯(33.68 %)、苯甲醇(17.31 %)和丁香酚(4.51 %)；从HLT012中共鉴定出31种香气成分，主要为α-罗勒烯(48.55 %)、乙酸苄酯(23.53 %)、苯甲醇(15.49 %)、水杨酸甲酯(3.37 %)和丁香酚(3.16 %)；从XL014中共鉴定出17种香气成分，主要为(E)-β-罗勒烯(70.79 %)、乙酸苄酯(17.48 %)、水杨酸甲酯(3.95 %)、丁香酚(2.61 %)和苯甲醇(1.99 %)。

2.3 蜡梅花香成分物质种类组成及含量分析

花香成分物质组成及其含量在不同基因型蜡梅中有差异(图3)。HLT040萜烯类物质占比最少，酯类和醇类物质占比最多。HLT015萜烯类物质占比最多，为80.58 %；酯类物质占比最少，为0.69 %。XL002是烷烃类和酮类占比最多，分别为0.94 %和9.75 %；XL014几乎不含有烷烃类(0 %)，酮类和醇类物质占比最少，分别为2.22 %和2.38 %。所以蜡梅花不同品种间具有独特香味，不仅与罗勒烯类型有关，有可能是萜烯类、酯类、醇类等种类含量、比例变化的共同结果。

2.4 蜡梅花各类花香成分物质主成分分析

由于蜡梅花香物质成分较多，为了更简明地描述各类花香成分物质对蜡梅花香的贡献，采用主成分分析法降维处理数据，对萜烯类、酯类、醇类、烷烃类、酮类和其他共6类花香物质成分做主成分分析。

第一主成分、第二主成分和第三主成分累计贡献率(图4、表3)达95.506 %，高于85 %，这3个成分基本可以反映原始数据[24]。

在主成分得分系数矩阵表中，各香气成分的绝对值反映了其对主成分贡献率的大小，绝对值越大，则贡献率也越大。从表4中可以看出，第一主成分中贡献率为萜烯类>酯类>其他>醇类>烷烃类；第二主成分中贡献率结果为烷烃类>酮类>其他>醇类>萜烯类>酯类；第三主成分中贡献率为醇类>酮类>烷烃类>其他>酯类>萜烯类。

F1=-0.348X1+0.341X2+0.165X3+0.057X4-0.161X5+0.241X6

表3 因子总方差分析结果

表4 成分得分系数矩阵

表5 不同基因型蜡梅品质预测评价

F2=-0.030X1-0.007X2-0.235X3+0.438X4+0.3951X5+0.287X6

F3=-0.152X1-0.222X2+0.872X3+0.340X4+0.370X5-0.337X6

F综=0.47374F1+0.34234F2+0.13898F3

上式中X1～X6是各个蜡梅花原始数据标准化后的数值，以3个主成分对应的方差贡献率为权重，将各品种主成分得分和相应的权重进行线性加权求和[25]，参考王建芳等[26]方法计算蜡梅的综合评价得分，预测综合得分较高的红心品种为XL002和XL003，素心品种为HLT040。

对8个基因型蜡梅花萜烯类、酯类、醇类、烷烃类、酮类和其他共6类花香物质组分做聚类分析(图5)发现在Euclidean值为2.5时可分为4类，HLT017、HLT040和HLT012这3个素心品种聚为一类；XL003和XL002这2个得分较高的红心品种聚为一类；HLT015和HLT016这2个萜烯类含量最多的红心品种聚为一类；XL014晕心品种单独为一簇，可较好地区分这8个品种。

3 讨 论

花香不仅能影响和调节人们的心理，还被广泛运用于产品、园艺疗法、森林康养[27-28]，蜡梅作为香花树种被大众喜爱。余莉[29]从9个蜡梅单株的挥发性成分中鉴定了70种化合物，其中以萜类物质为主，芳樟醇、β-罗勒烯、乙酸苄酯和水杨酸甲酯等是蜡梅花香的主要成分，发现其含量与内被片颜色无对应关系。蔡宝国等[30]采用了顶空固相微萃取技术从鄢陵腊梅鲜花中鉴定出芳樟醇、乙酸苄酯、吲哚、苯甲醇、反乙位罗勒烯、壬醛、丁香酚和桂醇等60种挥发性物质，并提出花香还可能与发香基团和挥发性成分的碳链结构有关。在本试验云南地区的供试材料中也含有乙酸苄酯、吲哚、苯甲醇、丁香酚、罗勒烯等共同挥发性物质，萜烯类化合物为盛开期蜡梅花的主要物质成分，这与周明芹[31]等研究结果一致。蜡梅花香物质成分组成和花香类型与蜡梅花自身的自身的花型、花径、花被片数无显著规律，但各自具有的独特香味可能与主要成分中罗勒烯类型有关，还有可能与萜烯类、酯类、醇类、烷烃类等种类含量、比例变化有关，这与冯楠[20]研究结果较为相似。目前，蜡梅已被加工成金茶、香枫茶、石梁茶和山蜡梅叶颗粒等[32]饮料和制剂，加上芳香物质中芳樟醇具有抗炎、抗癌、抗高脂血症、抗菌、抗伤害、镇痛、抗焦虑、抗抑郁等作用[33]，罗勒烯则能提高植物的抗虫能力，在生活中常被用于日用化妆品以及香精香料的制备[34]，苯甲醇作为一种芳香族化合物，可在麻醉过程中减轻神经和神经节的疼痛[35]，丁香酚有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤、促进透皮吸收、祛蚊等功效[36]，因此可根据芳香物质比例优化，调制出各种各样具有不同功能的配方，为香精类产品制备提供参考。

综合评价8个基因型蜡梅得分排名从高到低依次是：XL002、HLT040、XL003、HLT017、HLT012、HLT016、HLT015、XL014，结合聚类分析结果可以看出同一生长地，排名相近且内被片斑纹类型一致的聚为一类，因此推测香型可能与品种类型和种植地区有关，而造成它们品质差异的相关机理有待进一步研究。

4 结 论

采用顶空固相微萃取结合GC-MS对云南地区8个基因型蜡梅花香进行检测，并结合主成分分析和聚类分析，发现萜烯类化合物是蜡梅花盛开期的主要物质成分，且物质种类丰富，这类物质差异性较大的为基因型蜡梅是HLT015和HLT040；8个基因型蜡梅花可分为4类，第一类包括红心条纹HLT015、HLT016；第二类包括红心条纹XL002、XL003，第三类包括素心HLT012、HLT017、HLT040，第四类包括晕心条纹XL014，预测综合品质较好的红心蜡梅为XL002、XL003，素心蜡梅为HLT040，分类结果与内被片斑纹类型结果一致，这为进一步对蜡梅品种选育和开发利用以及代谢组学研究提供了参考依据。