柚皮素对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化损伤的作用

李再巧，王沙凝，吴 冲，田 迪，叶桂芝，宋 羚，桂明英，马 啸,*

(1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201)

【研究意义】 随着生活水平的不断提高，人们越来越重视各种原因引起的皮肤问题，如：皮肤老化、炎症、癌变等[1]。当人体自身拥有用于抵御氧化损伤的系统不足以抵御氧化损伤时，则需进行外界干预，那么更天然、更安全的抗氧化剂和抗衰老药物就成为人们迫切需要的物质[2]。如暴露于微小颗粒物(PM 2.5)、紫外线、灰尘等环境中都能引起皮肤老化从而引发一系列的皮肤问题：皱纹、异常色素沉着和皮肤干燥等，产生这些的原因是由于细胞过度暴露于活性氧(reactive oxygen species, ROS)等之类的自由基所引起的，也就是ROS的形成与自身抗氧化防御能力之间出现不平衡导致的结果[3]。【前人研究进展】已有研究表明多酚类物质能够抗氧化、抗炎和抗菌，同时对伤口愈合起作用。柚皮素属于二氢黄酮类化合物，以柚子等柑橘类水果中含量较丰富，也是一种天然抗氧化剂[4]。在菝葜、化红、枳实、桃叶等天然植物中也含有该类物质，具有和多酚类物质相似的功效：抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤清除自由基及抗氧化、免疫调节、预防动脉粥样硬化、抗衰老[5]等多种活性。因其抗氧化和抗炎作用可以对肝脏起到很好的保护作用[6]。【本研究切入点】与其他抗氧化剂相比，柚皮素有更强的效力和良好的作用，从而在生活中显示出很大的等待发掘利用的潜在价值。【拟解决的关键问题】研究柚皮素对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化损伤的作用，为柚皮素在皮肤保护方面的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株HaCaT细胞，中国科学院昆明细胞库；培养基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；青链霉素，碧云天公司；CO2培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台，苏州净化公司；低温高速离心机，Eppendorf公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；低速离心机，上海卢湘离心仪器有限公司；酶标仪，Molecular Devices公司；曝光机，北京科创锐新生物科技有限公司；倒置显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；细胞计数器，count star公司；一抗SOD2、CDK2，成都正能生物技术有限责任公司；DMSO、柚皮素和氧化试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HaCaT细胞复苏后，用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的DMEM培养基在5% CO2培养箱 (37 ℃，相对湿度95%)中培养，2～3 d传代1次，对数生长期的细胞用胰酶消化后再用培养基稀释制成细胞密度为1×106细胞混合液，接种在60 mm培养皿中继续培养3～4 d后进行给药处理。

1.2.2 构建细胞氧化损伤模型[7]首先将H2O2稀释为10 mmol·L-1浓度的母液，之后再用培养基稀释为100、200、300、400 μmol·L-1几个浓度，分别加到已经接种细胞且细胞铺满培养皿底部面积80%以上的60 mm培养皿中去处理4 h进行造模，为后续实验做准备。

1.2.3 MTT[8]活力测定 用处于对数生长期的细胞, 吸取0.25%胰酶1 mL消化8～10 min, 用培养基将细胞数量调整为5.0×104个 mL-1，每孔以200 μl的细胞培养基混合液体积接种在96孔培养板中，培养24 h后吸去上层培养基之后进行后续操作。实验组及空白对照组各200 μl，每个浓度设置6个复孔，在5% CO2(37 ℃，相对湿度95%) 条件下培养。培养结束前4 h，每孔加入MTT (5 ng·mL-1) 16 μl。培养结束时吸去上清液加入160 μl的DMSO 振荡10 min，充分溶解结晶物并测定吸光度(A492值)并计算分析。

1.2.4 细胞H&E染色 用胰酶消化下对数生长期的细胞在培养基稀释后接种在24孔板中，接种密度为每个孔10 000个细胞，在5% CO2(37 ℃，相对湿度95%) 培养箱中培养2 d后可以进行后续给药处理，结束后用95%乙醇固定20 min后用PBS洗两次；用苏木精浸泡4 min除去苏木精后用水洗3 s，然后用含有1%的乙醇溶液冲洗3 s，水冲洗10 s，氨水冲洗15 s，水冲洗10 s。之后用伊红染色2 min除去伊红，用水冲洗2 s，80%乙醇洗2 s，随后用95%乙洗5 min，100%乙醇洗10 min，然后在空气中自然干燥后进行拍照。

1.2.5 细胞克隆形成实验 用处于对数生长期的细胞，胰酶消化后收集并稀释后接种在6孔板中，每个孔中接种细胞数为500～1000个，放入5% CO2(37 ℃, 相对湿度95%) 培养箱中培养1 d后弃去培养基，加入含有不同浓度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)的培养基处理细胞2 d后换成正常培养基培养15 d后，用甲醇固定细胞10 min后0.1%结晶紫溶液染色15～30 min，回收结晶紫染液后多洗涤几次后放在空气中干燥之后即可拍照。接下来用10%的冰乙酸对结晶紫进行溶解在560 nm处测量吸光值后进行计算分析。

1.2.6 细胞划痕实验 先在6孔板背后做好标记(用标记笔配合直尺划线，线与线之间隔0.75 cm，至少划5条线)为方便后续划痕；把消化收集到的对数生长期的细胞稀释后以细胞密度为5×105每个孔加到6孔板中，每个实验组做3个重复孔，等细胞在显微镜下被观察到呈单层贴壁生长时，用提前消过毒的200 μl枪头和直尺并用在6孔板上方垂直划痕(用力均匀慢速，尽量避免倾斜)；之后用PBS多次清洗尽量洗干净划下来悬浮着的细胞；接着分别加入不同浓度的柚皮素处理，放入5% CO2(37 ℃, 相对湿度95%) 培养箱内培养12 h后置于显微镜下拍照。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 用不同浓度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)处理H2O2损伤的HaCaT细胞4 h后，以100∶1的比例配制混合均匀RIPA裂解液和PMSF用于提取HaCaT细胞总蛋白，之后用BCA试剂盒对所提蛋白进行浓度测定并

分装制成自己实验需要的蛋白样品，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来把不同分子量的蛋白分离开之后用转膜装置将电泳好的蛋白转移到PVDF膜上，再把膜放入含有5%脱脂奶粉的封闭液中在摇床上(室温下)封闭1 h后回收封闭液，用TBST清洗3次每次5 min后加入一抗放在4 ℃冰箱中的摇床上孵育12 h，回收一抗后用TBST清洗3次每次5 min，加入二抗在摇床上(室温下)孵育1 h后，用TBST清洗3次每次5 min(具体洗涤次数和时间可根据实际情况进行调整)，最后用曝光机进行拍照显影，用Image J软件进行分析。

1.2.8 MDA、SOD 水平检测 参照文献[9]根据丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒的说明书步骤逐一进行测定并统计结果。上述所有实验操作重复3次及以上。

1.3 统计学分析

图片分析用Image J软件，实验数据用Graphpad Prism 5统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 HaCaT细胞存活率

2.1.1 H2O2对HaCaT细胞存活率的影响 由图1可见，H2O2100、200 μmol·L-12个浓度处理与0 μmol·L-1(CK)处理相比，细胞活力在P<0.01水平差异显著，300、400 μmol·L-12个浓度处理与0 μmol·L-1(CK)处理相比，细胞活力在P<0.001水平差异极显著，表明随着H2O2的浓度升高，HaCaT细胞活力呈下降趋势。因此，后续实验选择300 μmol·L-1作为H2O2的建模浓度。

2.1.2 柚皮素对HaCaT细胞存活率的影响 由图2可见，与0 μmol·L-1(CK)处理相比，柚皮素50 μmol·L-1浓度处理的细胞活力在P<0.05水平有差异显著，柚皮素100、200 μmol·L-12个浓度处理的细胞活力在P<0.001水平差异高度显著。试验表明，随着柚皮素浓度的升高，HaCaT 细胞活力呈下降趋势。因此选择柚皮素浓度0～50 μmol·L-1为治疗浓度进行后续实验。

2.2 细胞H&E染色

由图3可见，与0 μmol·L-1(CK，a)处理相比，DMSO(25 μmol·L-1，b)处理对细胞无明显损伤作用；H2O2(300 μmol·L-1，c)处理的细胞形状明显发生变化，边缘皱缩明显，细胞饱满度不足；柚皮素(6.25 μmol·L-1，d；12.5 μmol·L-1，e；25 μmol·L-1，f)处理能够显著治疗H2O2损伤的HaCaT细胞形状越来越饱满，边缘皱缩逐渐减少，结果表明柚皮素对H2O2损伤的HaCaT细胞有治疗作用。

2.3 细胞克隆形成实验

由图4可见，与0 μmol·L-1(CK，a)处理相比，H2O2(浓度300 μmol·L-1，b)处理的细胞数量在P<0.001水平差异极显著。与0 μmol·L-1(CK，a)处理相比，用H2O2(浓度300 μmol·L-1)处理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(c)处理的细胞数量在P<0.001水平差异极显著，加柚皮素12.5 μmol·L-1(d)处理的细胞数量在P<0.05水平有差异，加柚皮素25 μmol·L-1(e)处理的细胞数量在P<0.01水平差异显著。结果表明柚皮素可恢复H2O2损伤HaCaT细胞的增殖生长，且柚皮素的处理浓度在12.5 μmol·L-1时效果更佳。

2.4 细胞划痕实验

由图5可见，与0 μmol·L-1(CK，b)处理相比，在H2O2(浓度300 μmol·L-1，c)处理后，细胞划痕闭合度在P<0.01水平差异显著。与0 μmol·L-1(CK，b)处理相比，用H2O2(浓度300 μmol·L-1)处理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(d)处理的细胞划痕闭合度在P<0.05水平有差异，柚皮素12.5μmol·L-1(e)处理的细胞划痕闭合度在P<0.01水平差异显著，柚皮素25 μmol·L-1(f)处理的细胞划痕闭合度在P<0.001水平差异极显著。说明柚皮素在低浓度下能够加快受氧化损伤HaCaT细胞快速生长。柚皮在浓度为6.25 μmol·L-1时效果更佳。

2.5 Western blot检测蛋白表达

由图6可见，与0 μmol·L-1(CK)处理相比，仅用H2O2(浓度300 μmol·L-1)的处理其SOD2、CDK2蛋白表达量在P<0.05水平有差异；与0 μmol·L-1(CK)处理相比，H2O2(浓度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13个处理的SOD2、CDK2蛋白表达量水平在P<0.05水平无差异，说明柚皮素能通过调节SOD2、CDK2蛋白对氧化损伤产生作用。

2.6 抗氧化试剂盒检测

由图7可见，与0 μmol·L-1(CK)处理相比，仅用H2O2(浓度300 μmol·L-1)的处理其MDA含量和SOD含量在P<0.001水平差异极显著；与0 μmol·L-1(CK)处理相比，H2O2(浓度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13个处理的MDA含量在P<0.05水平没有差异，H2O2(浓度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25 μmol·L-1处理的SOD含量在P<0.01水平差异显著，而H2O2(浓度300 μmol·L-1)加柚皮素12.5、25 μmol·L-12个处理的SOD含量在P<0.05水平没有差异。说明柚皮素能够治疗H2O2诱导的氧化损伤。

3 讨 论

本研究用H2O2成功建成HaCaT细胞衰老模型，这与已有的实验结果一致，在用柚皮素进行治疗处理的结果：细胞活性、形态、增值能力、抗氧化试剂盒和相关通路蛋白研究结果也与前人的研究结果保持一致。有实验证明黄酮能对H2O2诱导的氧化损伤起到保护作用[10]，从本实验结果来看柚皮素确实能对氧化损伤起到治疗作用；对氧化损伤的细胞在治疗效果和改善细胞形态上的作用较明显[11]，在对抗糖尿病和改善肝脏和肾脏功能方面也很有可能起到增强作用[12]；对成纤维细胞的增殖产生抑制作用、对细胞周期产生阻断作用，促进凋亡，抑制成纤维细胞的运动活性[13]。还可以通过抑制HaCaT细胞的凋亡从而保护皮肤减弱损伤[14]；能够起到抑制大鼠肺鳞癌的作用[15]；降低皮炎炎症程度[16]。凹纹胡蜂蜂巢中的黄酮同样具有抗氧化活性[17]，枸杞多糖[18]，杨梅黄酮[19]，花青素[20]，枸杞多糖[21]等都能对皮肤起到抗氧化进而保护皮肤的作用。皮肤老化随着年龄的增长而发生，表现为皮肤变薄、细纹出现、弹性降低等现象[22]。从实验结果来看，低浓度的柚皮素对皮肤衰老有治疗作用。通过调节HaCaT细胞增殖能够达到保护皮肤的作用[23]。类似的研究也证实了柚皮素能减缓氧化应激反应，延长寿命，延缓衰老相关疾病的发展[24]。本实验只是进行了初步的研究，日后将可以进一步探讨研究柚皮素的其他相关保护机制。

4 结 论

本研究主要是通过H2O2来建造HaCaT细胞的氧化损伤模型，从而通过几种方式来验证柚皮素对 H2O2造成的细胞氧化损伤的作用。结果表明H2O2在一定的浓度下能够降低HaCaT细胞的活性和生长速度并且影响其细胞形态，增强细胞的氧化反应，影响HaCaT细胞的正常生长。用具有抗氧化性能的柚皮素治疗处理，能够不同程度的降低氧化损伤，恢复细胞的正常生长。柚皮素在HaCaT细胞中展现出初步的抗氧化效果，进一步确定柚皮素的抗氧化性能，为柚皮素开拓更广阔的用途提供理论支持。