党参外源污染真菌的组成及其产毒特性

陈旭玉，赵祥升，刘小敏，杨美华,2*

(1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 海口 570311；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193)

【研究意义】中药材在种植、采收、加工和贮藏的过程中容易受到外源真菌的污染，特别是在贮藏条件不当的条件下容易引发霉变，霉变后的药材容易产生真菌毒素，影响中药材质量及药品的安全[1]。其中危害最大的真菌毒素有黄曲霉毒素(Aflatoxin)，赭曲霉毒素(Ochratoxin A)，伏马毒素(Fumonisins)等。曲霉属是污染中药材的主要优势菌群之一，曲霉属真菌产生的真菌毒素能引发肝毒性、肾毒性等重大毒性反应，严重威胁了消费者生命健康。【前人研究进展】党参Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益气补中，生津养血的作用，为常用的补气中药，用于脾肺虚弱，气短心悸，虚喘咳嗽等[2]。另外，党参还具有镇静解热、降血压、降血糖、保肝、抗疲劳和抗肿瘤等作用[3]。党参属于根类药材，易受真菌毒素污染。王文丽[4]年从党参表面分离到刺孢曲霉A.aculeatus并检测到赭曲霉毒素A (OTA),苏春燕等[5]研究党参的真菌总数高于三七和柴胡，且曲霉数高于青霉数。因此，党参外源真菌污染不可忽视。【本研究切入点】党参的外源真菌主要有哪些组成，除了报道的党参有赭曲霉毒素A的污染外，是否存在其他毒素的污染，以此为切入点进行研究。【拟解决的关键问题】本研究通过分析云南、河北、江西、重庆、广西、甘肃地区党参外源真菌，初步明确外源污染菌的种类及主要的产毒真菌，为防治党参外源污染真菌的防控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

分别从广西、江西、云南、甘肃、河北、重庆的药材市场购买党参。分装入无菌塑料袋内，带回实验室，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所资源中心朱平主任鉴定为党参Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.。

1.2 方法

1.2.1 药材表面真菌分离 称取10 g 党参，加入90 mL 无菌水和20颗玻璃珠的三角瓶中，置于恒温摇床中130 r/min室温震荡20 min，静置5 min，取上清液为10-1菌悬液，依次稀释成不同浓度，取0.5 mL均匀涂布至直径为90 cm的含有氯霉素的麦芽提取物琼脂Malt Extract Agar (MEA)培养皿中，放置25 ℃恒温培养箱中培养7 d(n=5)，计算菌落数，体视镜单孢分离进行纯化[6]。

1.2.2 菌株鉴定 将纯化的菌株在MEA培养基上培养7 d(25 ℃)。用无菌接种针从真菌菌落边缘处挑取一小块产孢结构，放置在载玻片上，加棉兰染液，盖上盖玻片后在显微镜下观察形态。随后根据形态学鉴定的初步结果，提取真菌DNA，青霉属和曲霉属真菌采用通用引物β-tublin，其他丝状真菌采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR序列扩增，ITS反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸7 min。β-tublin反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。所获得的PCR产物由广州艾基生物技术有限公司进行序列测定，测定的序列通过NCBI Blast软件与GenBank核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相关序列进行同源性比较。

1.2.3 产毒真菌菌株检测 将待测样品活化后，挑取少量菌丝于MEA液体培养基中，置于恒温摇床中，培养7 d (25 ℃，120 r/min)。加入甲醇 (甲醇与样品量的比为2∶1)，涡旋5 min，静置20 min，取100 μl上清液置于离心管中，加入700 μl样品稀释液混合均匀，此为待测液。吸取100 μl待测液滴加到金标微孔中，然后用滴管吹打金标微孔中的溶液，直至孔内红色物质完全溶解,指示结果与说明书比对，阳性样品采用UPLC-MS/MS确认。将培养7 d (25 ℃，120 r/min)的菌液，通过多功能净化柱处理，然后通过0.2 μl的滤纸过滤，然后上液相。UPLC-MS/MS条件：色谱柱：BEH C18(100 mm × 2.1 mm i.d., 1.7 μm, Waters Corp.)，柱温：35 ℃；流动相：2 mM乙酸铵水溶液 (A)-甲醇 (B，含-0.1 %甲酸)，梯度洗脱：0 min: 25 % A; 2 min: 45 % A; 10 min: 90 % A; 12 min: 90 % A; 12.1 min: 25 %，流速0.3 mL/min，进样量2 μl。质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI), 正离子模式，多反应离子监测 (Multiple reaction monitoring，MRM)扫描，毛细管电压2.5 Kv；离子源温度150 ℃；去溶剂温度350 ℃，目标物的质谱条件见表1[7]。

表1 黄曲霉毒素质谱条件Table 1 Mass spectrometry conditions for aflatoxin detection

2 结果与分析

2.1 党参外源污染真菌的分离

由表2显示，从广西、江西、云南、甘肃、河北、重庆的6个不同地区的党参表面共分离得到79株外源真菌，其中曲霉属Aspergillus34株，青霉属Penicillium30株、链孢霉属Neurospora10株，拟青霉属Paecilomyces4株，说明青霉属和曲霉属为党参的外源优势种群。

表2 6个地区党参外源真菌的分离和鉴定Table 2 Isolation and identification of exogenous fungi from C. pilosula in six regions

党参外源分离的曲霉属有塔宾曲霉A.tubingensis17株，烟曲霉A.fumigatus11株，黄曲霉A.flavus4株，棘孢曲霉A.aculeatus1株，黑曲霉A.niger1株，橘青霉P.citrinum21株和草酸青霉P.oxalicum9株。曲霉属中主要是以塔宾曲霉和烟曲霉为主，青霉主要是以橘青霉为主。

根据不同地区来源分析，广西党参共分离了28株，以橘青霉P.citrinum为优势菌，云南党参共分离了11株，以烟曲霉A.fumigatus为优势菌；河北党参共分离18株，以草酸青霉P.oxalicum为优势菌；江西党参共分离9株，以链孢霉菌Neurosporasp.为优势菌；重庆和甘肃党参分别分离5和8株，以塔宾曲霉A.tubingensis为优势菌；说明不同地区党参的表面污染真菌数量及种类存在差异。

2.2 黄曲霉毒素的产毒种类确定

检测到的阳性样品再次通过UPLC-MS/MS检测，图1-A为黄曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG2和AFG2标准品(26 ng/mL), 图1-B为黄曲霉GXDC1-5产生AFB1；图1-C黄曲霉 HBDC1-5产生AFB1和AFB2；图1-D黄曲霉YNDC1-5产生AFB1、AFB2和AFG2。不同的黄曲霉种产生的毒素种类不一样。

2.3 黄曲霉毒素含量的测定

真菌在液体培养基培养7 d后，其菌液净化后检测，其中黄曲霉GXDC1-5产生AFB1，浓度为11.91 ng/mL；黄曲霉HBDC1-5中产生AFB1和AFB2，浓度分别为9.28和1.53 ng/mL；黄曲霉YNDC1-5产生AFB1、AFB2和AFG2，浓度分别为76.09、2.36和1.49 ng/mL (表3)，说明不同的真菌产生毒素类型及能力有差别。

表3 不同黄曲霉产生毒素的结果Table 3 The results of the production of toxins by A. flavus

A: 黄曲霉毒素AFB1, AFB2, AFG1 和 AFG2标准浓度的色谱图；B, C和D: 分别为黄曲霉GXDC1-5，HBDC1-5 和 YNDC1-5产生黄曲霉毒素的色谱图A: Chromatogram of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 standard concentration；B, C and D: Chromatogram of AFTs produce by A. flavus GXDC1-5，HBDC1-5 and YNDC1-5,respectively图1 黄曲霉毒素标准品和黄曲霉产生毒素的色谱图Fig.1 Chromatogram of AFTs standard concentration and the AFTs produce by A. flavus

3 讨 论

真菌在自然界中分布广泛，在中药材中造成污染的情况非常普遍，不同地区因生态条件差异，所销售的不同种类药材受到污染性真菌的类群也有所不同。蔡飞对5个地区的甘草进行分离鉴定发现曲霉和青霉是霉变甘草的主要污染菌[6]。宋美芳等[8]研究昆明和玉溪地区绞股蓝发现其主要污染菌为曲霉属真菌。宋美芳等[9]报道三七污染真菌以淡紫拟青霉和橘青霉为优势菌；草果污染菌以淡紫拟青霉和黄曲霉为优势菌, 肾茶上的淡紫拟青霉和茄病镰刀菌随贮藏期的延长而增加，并有黄曲霉出现。陈娟[10]对药材市场上霉变甘草的污染真菌分析发现青霉(P.polonicum和P.crustosum)和曲霉(A.parasiticus)为优势真菌。陈娟[11]等对7种根类药材(甘草，巴戟天，黄芩，白术，三七，当归)污染真菌的分析发现青霉属真菌为主要污染真菌。本文分析党参外源污染真菌主要是青霉Penicillium和曲霉Aspergillus。可见中药材的外源污染物主要以青霉和曲霉为主。

本研究从党参中分离得到的真菌有：塔宾曲霉A.tubingensis，烟曲霉A.fumigatus，黄曲霉A.flavus，棘孢曲霉A.aculeatus，黑曲霉A.niger，橘青霉P.citrinum，草酸青霉P.oxalicum，链孢霉菌Neurospora等,其中云南地区、重庆地区和甘肃地区党参的外源污染真菌以曲霉属Aspergillus为优势菌，河北地区和广西地区党参外源真菌以青霉属Penicillium为优势菌，江西党参的外源真菌以链格孢为主，说明不同地区其外源真菌的种类及数量有差异。P.citrinum能够产生橘青霉素[12]，但在分离的橘青霉中没有检测到。黄曲霉毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉产生[13-14]，本研究共分离出4株黄曲霉，有3株产生毒素，说明黄曲霉中产生黄曲霉毒素的概率很大。

大量研究表明中药材中AFTS、OTA、FB、ZEA等真菌毒素的污染率较高，有的存在多种毒素污染的情况[15]。王文丽[4]年从党参表面分离到刺孢曲霉A.aculeatus并检测到赭曲霉毒素A (OTA)，本文从党参表面分离了3株黄曲霉，检测到黄曲霉毒素。党参中是否存在其他毒素有待下一步的研究。