长寿及冠心病人群miR-27a-3p血清表达水平的状况分析*

邱兰兰，陈 晶，彭均华，潘尚领

（广西医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，南宁 530021）

衰老是指伴随着年龄增长而产生的一系列生理和解剖学方面的变化，也是人体对内环境和外环境适应能力逐渐减退的表现，是生物体在生命后期阶段出现的全身性、进行性、多因素共同作用循序渐进的退化过程[1]。衰老是许多疾病的主要危险因素，包括神经退行性疾病、心脑血管疾病和肿瘤等[2]。我国人口老龄化日益严峻，预计到2050年，中国老年人口将达到4.8 亿，届时将占亚洲老年人口的四分之一[3]。老年人口的骤增将给医疗卫生行业带来巨大压力，因此迫切需要致力于衰老问题的相关研究，探讨老年相关性疾病发生发展的分子机制，寻找老年相关性疾病治疗靶点。

冠状动脉心脏病（coronary heart disease,CHD）又称冠状动脉疾病（coronary artery disease,CAD），是最常见的老年相关性疾病，也是全球成人发病率和死亡率的主要原因[4-5]，严重影响人类的寿限。老年、吸烟、高血压、低密度脂蛋白（LDL）水平高、高胆固醇和脂肪、糖尿病、肥胖等都会导致冠心病[6-7]。

MicroRNAs (miRNAs)是一种大小为19～25 个核苷酸的一类非编码RNA分子，是近年来发现的一种基因表达的转录后调控因子，通过与补体靶mRNA 结合，导致mRNA 翻译抑制或降解，在细胞分化、增殖和存活中发挥核心作用[8]。miRNAs可作为包括癌症、心血管疾病在内的许多疾病的诊断生物标志物[9-10]。有研究表明，miR-27a 和miR-329 表达水平与小鼠动脉粥样硬化斑块形成有关[11-13]。另有研究提示，EIF4A3 诱导的circ-BNIP3 通过靶向miR-27a-3p/BNIP3 加重心肌细胞缺氧损伤[14]。但miR-27a-3p 与长寿以及冠心病的关系及其如何影响机体寿限尚不清楚。本文旨在研究miR-27a-3p与长寿以及冠心病的关系及其影响机体寿限的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 长寿人群样本来源于本课题组2014 年构建的红水河流域长寿群体样本库。本次研究共抽取红水河流域样本库246 例作为研究对象，其中长寿组95 例，年龄范围为90～102 岁，平均（93.48±3.18）岁；老年组48 例，年龄65～84 岁，平均（75.15±4.27）岁；年轻组103例，年龄19～60岁，平均（48.48±9.18）岁。自述无重大疾病，生活可自理。冠心病患者及健康对照组样本来源于广西医科大学第一附属医院。其中冠心病患者共135 例，年龄为46～90 岁，平均（63.89±11.67）岁；健康对照组共126 例，年龄50～85 岁，平均（60.59±8.79）岁。冠心病纳入标准：（1）经冠状动脉造影术诊断冠脉中重度狭窄；（2）具有心电图心肌缺血的表现，如ST段抬高等；（3）符合《2018 版冠心病诊断与治疗指南》的诊断标准；（4）具备正常的认知与沟通能力，自愿参与本项研究。排除标准：（1）合并严重肝肾功能不全；（2）合并恶性肿瘤、血液疾病、自身免疫性疾病等；（3）合并有精神障碍性疾病。本研究已获得广西医科大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 流行病学资料 收集研究对象的身高、体重、血压等常规数据，并进行问诊和体格检查，初步排除健康对照组老年相关性疾病。

1.1.3 血液样本 研究对象空腹12 h以上，于次日清晨采集外周静脉血8 mL，其中5 mL 为非抗凝处理，采血后在室温静置30 min，3 000 g离心5 min后分离血清，部分用于检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG）、高密度脂蛋白（HDL）、LDL、C反应蛋白（CRP）等临床指标，部分用来提取总RNA并储存于-80 ℃超低温冰箱内备用，剩余部分血清于-80 ℃超低温冰箱储存备用。另外3 mL血液用ACD 抗凝处理后于-20 ℃冻存备用，用于基因组DNA提取。

1.1.4 主要试剂和仪器 血清FBG 水平使用日立7170 全自动生化分析仪进行检测；血脂水平采用“申能试剂”标准酶试剂盒提供的酶法检测；HDL和LDL采用酶联免疫一步法检测；血清总RNA提取试剂盒为Magen Hipure Liquid RNA Mini Kit；miRNA逆转录试剂盒购自于Sangon Biotech，包含2×miRNA RT Solution Mix 40 μL，miRNA RT Enzyme Mix 20 μL；实时荧光定量PCR（qPCR）试剂为2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix；无水乙醇购自于成都科隆化学品有限公司；异丙醇购自于天津市富宇精细化工有限公司；引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；荧光实时定量PCR 仪为罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 qPCR法检测血清miR-27a-3p相对表达量利用Magen Hipure Liquid RNA Mini Kit（R4163-03）试剂盒提取血清总RNA，按试剂盒说明书步骤进行裂解、沉淀、洗涤、洗脱RNA，最后将洗脱的RNA 逆转录为cDNA。使用生工miRNA 逆转录试剂盒（B532431）将总RNA 逆转录成cDNA，步骤如下：200 μL PCR 管中加入2×miRNA RT Solution Mix 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，总RNA 2 μg，后加RNase-Free Water 定容体积至20 μL，用移液器轻柔混匀后，PCR 仪中37 ℃60 min，85 ℃5 min条件下进行逆转录反应，逆转录产物进行后续qPCR 实验。使用加尾法设计miR-27a-3p引物，上游引物：5’-AGTGGCTAAGTTCCGCAA-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；以U6 snRNA 为内参，上游引物序列：5’-CAGCACATAT-ACTAAAATTGGAACG-3’，下游引物序列：5’-ACGAAT-TTGCGTGTCATCC-3’。qPCR 反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃3 min，扩增1 个循环，95 ℃15 s，扩增40 个循环，60 ℃20 s，扩增40 个循环，72 ℃10 s，40 个循环，95 ℃5 s，1 个循环，60 ℃60 s，1 个循环，95 ℃1 s，1 个循环。采用2-△△Ct方法计算miR-27a-3p 的相对表达水平。

1.2.2 观察指标 收集并观察研究对象的临床生化指标。血清FBG 使用日立7170 全自动生化分析仪进行检测；TC、TG、HDL、LDL 等血脂水平采用“申能试剂”标准酶试剂盒提供的酶法和酶联免疫一步法检测；CRP采用免疫层析法进行检测；载脂蛋白A（Apo A）、载脂蛋白B（Apo B）采用免疫比浊法进行检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，正态分布计量资料以均数±标准差()表示，多组均数比较采用F检验，两两比较采用LSD-t检验；偏态分布计量资料以中位数（四分位数）［M（QR）］表示，不同分组之间采用多独立样本非参数检验，相关关系采用Spearman相关分析；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 红水河流域人群相关资料分析

长寿组、老年组及年轻组年龄分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。老年组TC、HDL、LDL、FBG、Apo A、Apo B 及体重指数（Ibm）等比长寿组高（均P＜0.05）；老年组收缩压（SBP）比年轻组高（P＜0.05），而与长寿组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；三组CRP 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 血清miR-27a-3p 在红水河流域人群中的表达水平

相对于老年组，miR-27a-3p 在年轻组及长寿组血清中表达量明显上调（P＜0.05）。各组miR-27a-3p的表达水平在性别中比较（P＞0.05），见表2。

2.3 血清miR-27a-3p 与红水河流域人群各临床参数的关系

血清miR-27a-3p 表达水平与FBG、SBP、Ibm、CRP、Apo A 及Apo B 呈负相关关系（P＜0.05），与DBP、HDL、LDL、TC、TG无相关关系（P＞0.05），见图1。长寿组中，血清miR-27a-3p表达水平与SBP、DBP、Ibm、CRP 及Apo B 呈负相关关系（P＜0.05），与FBG、HDL、LDL、TC、TG、Apo A 无相关关系（P＞0.05），见图2；在老年组中，血清miR-27a-3p 表达水平与DBP、CRP 呈负相关关系（P＜0.05），与Ibm、FBG、SBP、HDL、LDL、TC、TG、Apo A、Apo B无相关关系（P＞0.05），见图3。在年轻组中，血清miR-27a-3p 表达水平与CRP 及Apo B 呈负相关关系（P＜0.05），与Ibm、FBG、SBP、DBP、HDL、LDL、TC、TG、Apo A无相关关系（P＞0.05），见图4。

表1 红水河流域人群相关资料分析结果

表1 红水河流域人群相关资料分析结果

与老年组比较，▲P＜0.05；与年轻组比较，*P＜0.05。

表2 各组血清miR-27a-3p表达量M（QR）

图1 血清miR-27a-3p与Ibm、FBG、SBP、CRP、Apo A、Apo B的关系（整体）

图2 血清miR-27a-3p与Ibm、SBP、DBP、CRP、Apo B的关系（长寿组）

图3 血清miR-27a-3p与DBP、CRP的关系（老年组）

图4 血清miR-27a-3p与Apo B、CRP的关系（年轻组）

2.4 miR-27a-3p在冠心病患者血中表达水平

qPCR法检测冠心病患者及健康对照组中miR-27a-3p的表达水平，相对于健康对照组，miR-27a-3p表达水平在冠心病患者血清中下调（P＜0.05），见图5。

图5 冠心病患者血中miR-27a-3p表达水平

3 讨论

冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变最常见的类型，而内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的早期标志。大量研究表明，miRNA在动脉粥样硬化和介导细胞间通讯中起重要作用。Lovren 等[15]发现，剪切力刺激的KLF2介导的人脐静脉内皮细胞分泌的外泌体富集在miR-143/145 中，控制平滑肌靶细胞基因的表达。且有研究证明，间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的外泌体miRNA 具有抗动脉粥样硬化的作用。Li等[16]通过喂养小鼠以高脂饮食，并在小鼠模型中静脉注射MSCs 外泌体12周后发现，MSCs 分泌的miR-let7 通过IGFZBP1/PTEN通路抑制巨噬细胞的浸润，通过HMGA2/NFκB通路促进M2细胞的极化。MSCs外泌体减少了小鼠动脉粥样硬化斑块面积，大大减少了巨噬细胞对板块的浸润。Xing等[17]也发现脂肪来源的MSCs的外泌体miR-342-5p 对内皮细胞具有抗动脉粥样硬化作用。He 等[18]发现用氧化LDL 处理细胞会导致内皮细胞中外泌体miR-155水平的提高，miR-155可使巨噬细胞向M2 细胞极化，从而抑制炎症反应。此外，Chang 等[19]发现动脉粥样硬化损伤过程中外泌体miR-92a 的释放增加。MiR-92a 在局部微环境中被巨噬细胞吸收，通过靶向调控KLF4 激活巨噬细胞，参与动脉粥样硬化斑块的形成。

以上研究表明，miRNA与冠心病等心血管疾病的发生发展密切相关。而年龄是冠心病明确的独立危险因素[20]，说明miRNA可通过影响冠心病的发生进而影响机体寿限。本研究发现，红水河流域一般老年人血清miR-27a-3p 的表达水平低于长寿组和年轻组（P＜0.05），而长寿人群的血清miR-27a-3p表达水平与年轻对照人群相当，且miR-27a-3p表达水平在冠心病患者血清中下调（P＜0.05）。进一步分析miR-27a-3p 表达水平与冠心病危险因素相关关系时发现，在年轻组中，miR-27a-3p 表达水平与TG、TC、Ibm、LDL、SBP、DBP 等冠心病危险因素均无相关关系（P＞0.05），符合冠心病在年轻人群中发病率低的相关现状；而在年龄大于90岁的长寿群体中，miR-27a-3p 表达水平与SBP、DBP、Ibm、Apo B及CRP 等冠心病危险因素呈负相关关系（P＜0.05）。基于以上关于miRNA与冠心病相关的机制研究，笔者猜测，miR-27a-3p 可能通过靶向抑制相关转录本的翻译，保护内皮细胞功能，降低冠心病的发生率进而影响机体寿限。

综上所述，miR-27a-3p 在长寿人群血清中表达水平高于普通老年人群，在冠心病患者中低表达，且与多种冠心病危险因素呈负相关关系，提示miR-27a-3p通过参与某种调控机制影响冠心病的发生并最终影响机体寿限。