罕见缺失型α-珠蛋白基因突变导致α-地中海贫血Hb H病*

何恩怡，李树全，肖 璇，李汶蔚，陈 萍△

（1.中国医学科学院地中海贫血防治研究重点实验室，南宁 530021；2.广西地中海贫血防治重点实验室，南宁 530021）

α-地中海贫血是一种单基因疾病，其分子基础是位于16 号染色体（16p13.3）上的α-珠蛋白基因簇异常导致α-珠蛋白链生成减少或缺如[1]。中间型α-地中海贫血的血红蛋白H病（Hb H病），是一条染色体上的HBA2和HBA1基因同时缺失以及另一条染色体上的HBA2 或HBA1 基因缺失或点突变，分别导致缺失型和非缺失型Hb H病。在中国人群中，常见的缺失型α-地中海贫血基因突变主要是东南亚缺失（--SEA）、右侧缺失（-α3.7）和左侧缺失（-α4.2），常见的非缺失型α-地中海贫血基因突变是Hb Constant Spring（Hb CS）、Hb Quong Sze（Hb QS）和Hb Westmead（Hb WS）[2-3]。目前报道的Hb H病大多数是由于上述这些常见的基因突变导致的，但也有一些罕见基因突变的Hb H病应用常规方法未能检测，在临床上容易漏诊或误诊。本研究报道一种罕见的缺失型α-地中海贫血基因突变导致Hb H 病的临床和实验室特征，为临床诊疗和遗传咨询提供依据和指导。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2020 年5 月至2021 年2 月在广西医科大学第一附属医院就诊、经Hb 分析确诊为Hb H 病的88例患者为研究对象，其中男39例，女49例。在88例病例中检测出3 例携带-α27.6缺失型突变的患者。3 例均来自广西壮族自治区，中度贫血，无肝脾肿大，无输血史。病例1为11个月大的女婴，病例2为44岁的女性，病例3为10岁男童。

1.2 血常规分析

抽取外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸枸橼酸葡萄糖抗凝，采用血细胞自动分析仪（CELLDYN1700，雅培公司，美国）检测红细胞（RBC）计数、血红蛋白（Hb）含量、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血细胞比容（HCT）、红细胞体积分布宽度（RDW）。

1.3 Hb分析

采用高效液相色谱仪(Hb Variant Ⅱ,伯乐公司，美国)对Hb H、Hb A2、Hb F进行定量分析。

1.4 DNA提取

取500 μL 全血，采用核酸自动提取仪（Lab-Aid 820，厦门百维信生物科技有限公司）提取DNA，按照试剂盒(Lab-Aid 820 核酸提取Midi 试剂，厦门致善生物科技股份有限公司)说明书操作。取1 μL DNA 样本用紫外分光光度计（Nanodrop 2000/2000CC，赛默飞公司，美国）测定DNA浓度和纯度。

1.5 α-地中海贫血基因突变分析

1.5.1 缺失型基因突变分析 采用跨越断裂点PCR（Gap-PCR）检测α-地贫常见的4 种缺失型基因突变，包括--SEA、--α3.7、--α4.2、--THAI（缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒，深圳市亿立方生物技术有限公司）。PCR 扩增：取4 μL DNA 样本加入21 μL PCR反应液中。PCR反应条件：50 ℃预热5 min，96 ℃预变性5 min；98 ℃变性45 s，64 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共35 个循环；72 ℃继续延伸10 min（Veriti96型，赛默飞科技公司，美国）。电泳：配制1.2%的琼脂糖凝胶，取5 μL 扩增产物加入凝胶孔，同时用5 μL 的DL2000 作为DNA Marker，在5V/cm 电压下电泳60 min，置于凝胶成像系统（GeldocXR+，伯乐公司，美国）上观察、拍照。

1.5.2 非缺失型基因突变分析 应用荧光PCR 熔解曲线法（FCMA）检测α-地贫常见的3种非缺失型基因突变，包括Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突变（非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，厦门致善生物科技股份有限公司）。取n×19.8 μL PCR反应液、n×0.2 μL酶混合液放入1.5 mL离心管中，振荡混匀后瞬时离心，分别以每管20 μL 分装于PCR 反应管中，再加入5 μL DNA 样本，混匀后放入PCR 仪。PCR 反应程序：50 ℃UNG 酶处理2 min，95 ℃预变性10 min；降落循环程序（10 个循环），95 ℃30 s，70 ℃15 s（每个循环下降1 ℃），76 ℃20 s；PCR循环程序（50 个循环），95 ℃15 s，55 ℃15 s，76 ℃20 s。熔解曲线分析程序：95 ℃1 min，35 ℃3 min，40 ℃～85 ℃（每0.4 ℃采集通道荧光信号）。

1.5.3 α-珠蛋白基因测序 应用二代测序技术对未检测出上述基因突变的样本进行检测（华大基因公司），检测结果与正常的α-珠蛋白基因序列进行对比。

2 结果

2.1 血常规、血红蛋白分析及α-地中海贫血基因突变检测结果

3例均表现为中度小细胞低色素贫血，Hb 平均值为76.8 g/L，MCV、MCH和MCHC均下降。无黄疸、肝脾肿大和输血史。血红蛋白分析结果显示，3 病例均有Hb Bart’s 和Hb H，依次为Hb Bart’s 7%，Hb H 4%和Hb H 3%，见表1。

3例病例的α-地中海贫血缺失型基因检测均发现有--SEA 缺失突变，未检出其他缺失型基因突变。3例病例及对照病例的Gap-PCR产物电泳结果见图1，3例病例的电泳结果无正常扩增条带。非缺失型基因检测未发现携带Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突变。

表1 血常规、血红蛋白分析及基因检测结果

图1 缺失型α-地中海贫血Gap-PCR检测结果

2.2 高通量测序结果

高通量测序结果显示，在3 例病例中检测到α-珠蛋白基因簇的9 079～36 718 bp 之间缺失，缺失长度共27 640 bp（NG_000006.1:g.9079_36718del27640），包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2基因，α1 基因未受影响。同时，在3 例病例中均检出--SEA缺失型突变。

3 讨论

近年来国内、外陆续报道一些罕见缺失型突变导致α+-地中海贫血，在中国人群中发现的有-α2.4、-α2.7、-α6.3、-α6.9、-α21.9、-α27.6等缺失型突变，国外报道的包括-α3.5、-αMAL3.5、α（α）5.3、-α7.9、-α16.6[4-6]等缺失型突变。

上述突变中包含了α2-珠蛋白基因缺失，但未影响α1-珠蛋白基因并导致Hb H病的突变有-αMAL3.5（NG_000006.1:g.32745_36301del3557）、-α6.9（NG-000006.1:g.29785-36746 del6962bp）、-α21.9（NG_000006.1:g.14373_36299del21927）及-α27.6（NG_000006.1:g.9079_36718del27640）等缺失。2015 年Abdul 等[7]首次在马来西亚华裔发现-αMAL3.5缺失突变，之后Zhao等[5]在广东省一个家系中也发现了该突变，其复合--SEA缺失突变时导致Hb H病。报道的5 例Hb H 病患者中，有1 例表现为轻度贫血（Hb 96 g/L，MCV 51.3 fL，MCH 15.2 pg），其余均为中度贫血（Hb 79～81.2 g/L，MCV 53.2～60.6 fL，MCH 13.4～19.8 pg）。其杂合子无贫血，仅MCV、MCH 接近正常值下限。2019 年，Zhuang 等[8]报道了福建省一个家系的-α6.9缺失突变，复合--SEA缺失突变时导致Hb H 病，表现为轻度小细胞低色素贫血（Hb 111 g/L，MCV 65.8 fL，MCH 21 pg），无黄疸及肝脾肿大。2013 年，Long 等[9-10]和Pang 等[11]在广西省钦州市发现-α21.9缺失突变的存在。复合--SEA缺失突变时导致Hb H病，有中度小细胞低色素贫血（患者1：Hb 77 g/L，MCV 49.5 fL，MCH 15.4 pg；患者2：Hb 71 g/L，MCV 44.3 fL，MCH 12.9 pg），无黄疸；其杂合子仅各项血液学指标接近正常值下限（Hb 126 g/L，MCV 84.3 fL，MCH 26.2 pg）；复合-α2.4缺失突变和Hb CS 时，表现为轻度贫血（患者1：Hb 113 g/L，MCV 67.1 fL，MCH 21.6 pg；患者2：Hb 103 g/L，MCV 74.6 fL，MCH 24.3 pg）。

关于-α27.6缺失型突变，已有的病例均在福建省内发现。Wei 等[12]首次发现由-α27.6缺失突变复合--SEA的Hb H 病，-α27.6缺失范围在α-珠蛋白基因簇上的9079～36718bp 之间，并插入了6 个核苷酸（AATCCC）。缺失包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2 基因，α1 基因未受影响。该患儿为中度贫血（Hb 79 g/L，MCV 54.1 fL，MCH 13.7 pg），Hb 分析显示：Hb A21.7%，Hb F 1.9%。之后Wang等[13]报道了1例由-α27.6/--SEA导致的Hb H病，患者为中度贫血（Hb 83 g/L，MCV 53.2 fL，MCH 13.4 pg），92%的RBC 中发现了Hb H 包涵体。2018 年，Huang 等[14]报道了3 例-α27.6缺失突变复合--SEA的Hb H 病，3 例均表现为小细胞低色素贫血，未检测到Hb H。其中先证者1 为轻度贫血（Hb 96 g/L，MCV 51.3 fL，MCH 15.2 pg），Hb分析显示Hb A21.5%；先证者2 为中度贫血（Hb 81.2 g/L，MCV 53.2 fL，MCH 19.8 pg），Hb 分析显示Hb A21.6%；先证者3为中度贫血（Hb 78 g/L，MCV 60.6 fL，MCH 16.7 pg），Hb分析显示Hb A21.5%。上述患者均无黄疸、肝脾肿大，无输血史。上述5 例-α27.6/--SEA基因型的Hb H 病大多数为中度贫血，Hb 分析显示Hb A2降低，但未检出Hb H或Hb Bart’s。

本研究检测到3 例-α27.6缺失突变复合--SEA缺失突变的Hb H 病，均有中度贫血，与上述报道相似。但上述5 个病例中有1 例为轻度贫血，因而该类型基因突变与Hb H 病临床贫血的轻重程度的关系有待更多的病例分析。

本文病例均在Hb 分析中检测出Hb Bart’s 和Hb H。Hb Bart’s 为7%，Hb H 3%～4%，符合Hb H病的Hb分析特征。Hb H病的基因突变导致α-珠蛋白肽链生成减少，多余的β-珠蛋白肽链聚合成四聚体（Hb H）及γ-珠蛋白肽链聚合成γ 四聚体（Hb Bart’s），因而在Hb 分析中可检测到Hb H（0.8%～40%），及少量的Hb Bart’s。本类型Hb H 病检出的难度较大，较容易漏诊或误诊。

本文首次在广西地区发现-α27.6缺失突变导致的α-地中海贫血Hb H 病，有中度贫血，Hb 分析有Hb Bart’s 和Hb H。-α27.6缺失突变较为罕见，临床上容易漏诊。本文研究为α-地中海贫血的遗传咨询和临床诊疗提供了依据和指导。