衰老标记蛋白30在不同月龄大鼠晶状体上皮细胞中的表达及其作用*

李思雨，王 洁，Mahamane Doby Djibril，谢子康，左慧懿，唐承业，唐东永，衷 昕，梁 皓

（广西医科大学第一附属医院眼科，南宁 530021）

衰老标记蛋白30（SMP30）是一种随年龄增长而逐渐减少的钙调节蛋白[1]，其含量不受性别因素的影响，是一种新型的抗衰老因子[2]。目前对SMP30 的研究主要集中在肝、肾及心脏等领域，并发现其具有抗细胞凋亡、抗氧化损伤、调控细胞增殖、参与维生素C合成、维持细胞内钙离子稳态等作用[3-7]。但目前有关SMP30 在晶状体上皮细胞（LECs）中的表达情况及其作用鲜少报道。本研究通过观察大鼠自然衰老过程中晶状体形态变化和LECs 凋亡情况，并检测不同月龄大鼠LECs 中SMP30 的表达，以明确大鼠LECs 中SMP30 的表达与年龄的关系，为研究SMP30 在LECs 中的作用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物 24 只不同月龄（0～1 月龄8 只、8～9月龄16 只）SPF 级Wistar 大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有大鼠均饲养于SPF 级动物房内，给予常规固体饲料，自由饮水。本研究动物实验已取得广西医科大学实验动物伦理委员会批准，审批号：201909018。

1.2 实验分组及自然衰老动物模型的建立 将大鼠按照鼠龄分为3组：1～2月龄组、9～10月龄组、18～19月龄组。首先购买8只8～9月龄大鼠，饲养至17～18月龄时，再次购买8只8～9月龄和8只0～1月龄大鼠，均继续饲养1 个月，即获得18～19 月龄、9～10 月龄、1～2月龄的3组大鼠。

1.3 晶状体形态观察 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，用美丽多复方托吡卡胺滴眼液对大鼠进行散瞳，共滴两次，每次间隔5 min。通过裂隙灯观察晶状体是否浑浊并拍照。

1.4 血清氧化应激指标水平检测 大鼠深度麻醉后开腹，通过腹主动脉取血，静置30 min后离心，取上层血清，检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）含量。试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 TUNEL 法检测大鼠LECs 凋亡 麻醉处死大鼠后迅速摘取眼球，置于甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，5 μm 连续切片。切片经脱蜡、水化、洗涤、蛋白酶K工作液消化、破膜工作液破膜处理，按照TUNEL 试剂盒说明书（Servicebio 公司）配置TUNEL反应液，染色及血清封闭过程严格按照试剂盒说明书进行操作，最后DAB显色、苏木精复染后，脱水封片。显微镜下观察染色结果，凋亡细胞核被染成棕黄色，正常细胞核呈蓝色。选取晶状体前囊膜区域，Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=LECs凋亡细胞数目/LECs总数×100%。

1.6 间接免疫荧光法检测大鼠LECs 中SMP30 蛋白表达 切片脱蜡、水化、EDTA 抗原修复、PBS 洗涤，BSA 封闭30 min，弃去BSA，放入湿盒中，加SMP30 鼠单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology 公司），存放于4°C 冰箱中孵育过夜。用PBS 洗后加相应二抗室温下避光孵育50 min，PBS洗涤，加DAPI，10 min后PBS洗涤，封片。荧光显微镜下观察染色结果，选取晶状体前囊膜区域拍照，使用Image J软件计算荧光强度。荧光强度越高，表示SMP30蛋白表达越高。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量比较 随着大鼠月龄的增长，其血清中SOD 和GSHPx活性呈降低趋势，而MDA含量呈升高趋势。18～19 月龄组SOD 活性低于9～10 月龄组和1～2 月龄组，GSH-PX 活性显著低于1～2 月龄组，MDA 含量明显高于9～10 月龄组和1～2 月龄组（均P＜0.05）；9～10月龄组GSH-PX活性明显低于1～2月龄组（P＜0.05），而SOD活性和MDA含量与1～2月龄组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3组大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量比较

表1 3组大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量比较

与1～2月龄组比较，*P＜0.05；与9～10月龄组比较，#P＜0.05。

2.2 晶状体形态学观察 散瞳后通过裂隙灯观察显示3组大鼠晶状体均透明，见图1。

2.3 3 组细胞凋亡率比较 1～2 月龄组、9～10 月龄组、18～19 月龄组大鼠LECs 凋亡率分别为（27.51±9.39）%、（32.84±3.76）%、（45.50±9.18）%，18～19 月龄组大鼠LECs 凋亡率显著高于1～2 月龄组和9～10月龄组（P＜0.05)，1～2 月龄组与9～10 月龄组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.4 大鼠LECs 中SMP30 蛋白的表达 SMP30 在3组晶状体囊膜LECs中均呈阳性表达，FITC染色呈绿色荧光。1～2月龄组、9～10月龄组、18～19月龄组大鼠LECs 中SMP30 表达的荧光强度分别为4.36±1.98、2.73±1.14、0.75±0.39，组间两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中1～2月龄组荧光强度最高，9～10月龄组次之，18～19月龄组最低，见图3。

图1 3组大鼠晶状体裂隙灯下形态学观察图像

图2 TUNEL染色观察3组大鼠LECs凋亡情况（×400）

图3 间接免疫荧光法染色观察3组大鼠LECs中SMP30蛋白表达（×400）

3 讨论

Wistar 大鼠是生物医学研究中常用的实验动物，具有饲养简单、容易繁殖、机体生理病理变化和代谢类型与人类比较接近等特点。大鼠的鼠龄与人的年龄有一定对应关系，即1 月龄左右大鼠相当于人的幼年阶段，6 月龄左右大鼠相当于人的青年阶段，12 月龄左右大鼠相当于人的成年阶段，大于18月龄大鼠相当于人的老年阶段[8]。本实验大鼠长时间饲养过程中可能会受到饲养环境、自身疾病等无法控制因素的影响，与研究目的综合考虑，选择把大鼠分为1～2 月龄组、9～10 月龄组和18～19 月龄组3组，模拟人的自然衰老过程，建立大鼠自然衰老模型，研究在大鼠自然衰老过程中，血清和晶状体衰老指标的改变以及LECs中SMP30的表达变化。

衰老的机制十分复杂，研究者提出机体内自由基代谢紊乱、细胞衰老、基因组不稳定、端粒缩短及表观遗传学改变等均为衰老形成的重要因素[9]，其中氧自由基学说是发展较早、学界接受度较高的一种衰老理论，此理论指出氧化应激是导致衰老的重要原因。细胞内活性氧（ROS）的生成能力与清除能力处于动态平衡中，若二者失去平衡，将导致氧化应激[10]。SOD 与GSH-PX 是细胞内的抗氧化剂，通过清除细胞内的氧自由基来发挥抗氧化作用[11]。ROS 产生过多会导致细胞脂质过氧化，造成MDA等脂质过氧化物堆积，使细胞受损、生命活力低下，导致器官功能不断减退，机体逐渐进入衰老阶段[12]。因此，在衰老动物体内，SOD、GSH-PX 的活性较低，MDA 的含量较高。目前常用MDA、SOD和GSH-PX 等指标验证衰老模型的建立是否成功。本研究结果显示，随着大鼠月龄的增长，其血清中SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05)。结果表明，本实验的自然衰老模型构建成功。

SMP30 是一种随年龄增长而逐渐减少的钙调节蛋白[1]，其含量不受性别因素的影响，是一种新型的抗衰老因子[2]。近年来研究发现，SMP30 的表达与LECs 的凋亡相关。在临床研究中，SMP30 在人晶状体前囊膜LECs 周边部表达较强，中央部表达较弱，LECs 的凋亡程度与SMP30 的表达呈负相关关系[13-14]。在细胞体外培养研究中，人LECs 系SRA01/04 细胞在正常培养状态下，下调SMP30 的表达可使细胞凋亡率升高[15]；在高钙及氧化状态下，SMP30 对SRA01/04 细胞可产生促增殖、抗氧化及抗凋亡的保护作用，且与表达量呈正相关关系[16-19]。本研究探讨SMP30 在不同月龄大鼠LECs中的表达变化，发现在大鼠自然衰老模型中，随着月龄的增加，尽管大鼠晶状体未出现形态学改变，但其LECs 的凋亡程度加重，SMP30 表达量已经减少，由此推测，在大鼠衰老的过程中，SMP30可能作为一种保护性蛋白，参与了LECs的细胞损伤进程，起到一定程度的抗凋亡作用。本实验的不足之处在于仅从细胞层面检测到LECs 的凋亡变化，没有观察晶状体形态学的改变，可能由于大鼠个体差异大、月龄不够大或者LECs 代谢障碍程度尚未超过SMP30 对LECs 的保护作用等，具体因素还需后续研究。

综上所述，随着大鼠月龄的增加，其LECs凋亡增加，SMP30表达降低，提示SMP30可能是LECs的保护因子，在大鼠衰老过程中具有抗LECs 凋亡的保护作用。但是，SMP30 对LECs 发挥保护作用的具体机制仍有待进一步研究。未来，本组拟通过改变大鼠眼内SMP30 的表达量，进一步观察SMP30抗凋亡、抗氧化和维持细胞内钙离子稳态等方面的调控作用。