微波消解－原子吸收火焰法测定肝精补血素口服液中总铁含量*

2021-05-24申二永金建闻

中国药业 2021年9期

申二永，金建闻，李杨

（1. 河南省食品药品检验所·国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，河南郑州 450018；2. 河南省食品药品审评查验中心，河南郑州 450018）

肝精补血素口服液是由肝精膏（由鲜猪肝提取）、党参、枸杞子、枸橼酸铁铵、维生素B15 种原料制成的非处方药，具有养血益气、滋补肝肾功效，对于缓解贫血症状和提升血红蛋白水平疗效较好，可用于成人及儿童缺铁性贫血的治疗。肝精补血素口服液对改善缺铁性贫血的症状，显著强于西药铁制剂［1－3］。枸橼酸铁铵为有机铁剂，是该方中核心的造血原料，故需控制好总铁含量。肝精补血素口服液现行质量标准为《卫生部药品标准中药成方制剂（第十三册）》（WS3－B－2530－97）［4］。经实际检验及调研生产企业，现行标准的方法存在含量偏低和重复性差的问题，各相关生产企业均建议修订或提高该检验方法。本研究中建立了微波消解－原子吸收火焰法测定肝精补血素口服液中总铁含量的方法［5－7］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AAS－ZEEnit700 P 型原子吸收分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；GBC SavantAA 型原子吸收分光光度计（澳大利亚GBC 公司，配有AS－1 型铁空心阴极灯）；MARS6 型微波消解仪（美国CEM 公司）；Milli－Q型超纯水处理系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试药

铁元素标准溶液（标示质量浓度为1 000 mg／L，批号为19C006－8，国家有色金属及电子材料分析测试中心）；65%纯硝酸（优级纯，德国Merck 公司）。肝精补血口服液（厂家A，河南灵佑药业股份有限公司，批号分别为20140805，20150510，20150805；厂家B，河南省奥林特药业有限公司，批号分别为170101，170102，180901，180902，190801，191213，200301，200302；厂家C，开封康诺药业有限公司，批号分别为H18010，H18012，H18013，H18014，H18015，H18016，H18017，H18018，H18019，H18020）。

2 方法与结果

2.1 元素测定条件

测定波长：248.3nm；灯电流：4mA；狭缝宽度：0.2 nm。采用对应的空心阴极灯，火焰原子吸收法测定铁（Fe），氘灯背景校正［8－11］。

2.2 微波消解程序升温条件［12－13］

详见表1。

2.3 溶液制备

精密量取本品1 mL，置适宜的聚四氟乙烯消解罐内，加入硝酸10 mL，混匀，盖好盖子，置微波消解炉内按程序升温条件进行消解。消解完全后，赶酸，剩余液体用2% 硝酸溶液转移至50 mL 容量瓶中，精密量取2 mL，用2%硝酸溶液稀释至20 mL 容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。同法制备试剂空白溶液。

表1 微波消解程序升温条件Tab.1 Temperature－programmed conditions of microwave digestion

2.4 方法学考察

标准曲线建立：取铁元素标准溶液（质量浓度为1 000 mg／L），用2%硝酸溶液分别稀释制成质量浓度为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg／L 的系列标准溶液，以质量浓度（X，mg／L）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线。按2.1 项下条件进行测定，得线性回归方程Y ＝0.006 9 X ＋0.062 7，r ＝0.999 2（ n ＝6）。结果表明，总铁质量浓度在0.5 ～5.0 mg／L 范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：取适量铁元素标准溶液，加2%硝酸溶液，配制得质量浓度为3 mg／L 的对照品溶液，按2.1项下测定条件，连续测定6 次。结果的RSD 为1.42%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为H18016）6 份，按2.3项下方法制备供试品溶液并测定。结果铁吸收度的RSD 为1.13%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（开封康诺药业有限公司，批号为H18016），按供试品溶液制备方法制备，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进行测定。结果铁吸收度的RSD 为1.01%（n ＝6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为H18016，铁质量浓度为1.498 mg／mL）0.5 mL，量取9 份，分别精密加入铁元素标准溶液（质量浓度为1 000 mg／L）0.4，0.5，0.6 mL，按2.3 项下方法制备供试品溶液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定铁的含量，计算回收率。结果见表2。

2.5 不同人员操作及新旧方法结果比较

原容量法标准：精密量取样品10 mL，置250 mL 碘量瓶中，加水10 mL，加硫酸溶液（1 ∶1，V／ V）2 mL，摇匀，放冷至15℃，加入1%高锰酸钾溶液6mL，盐酸15mL，40%碘化钾溶液5 mL，摇匀，在暗处放置15 min，加水50 mL，用硫代硫酸钠液（0.05 mol／L）滴定，近终点时加入淀粉指示液2 mL，继续滴定至紫色消失，并将滴定结果用空白试验校正（试剂中不加1%高锰酸钾液），即得每1 mL 硫代硫酸钠液质量浓度（0.05 mol／L）相当于2.792 5 mg 的铁溶液。取样品13 批，分别按原容量法标准及原子吸收火焰法操作，对不同人员操作及新旧方法测定结果进行比较。结果见表3。

表2 加样回收试验结果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝9）

表3 不同人员操作及新旧方法测定结果比较（mg／mL）Tab.3 Comparison of the results between two operators with new and old methods（mg／mL）

2.6 不同品牌仪器测定结果比较

取样品3 批（批号分别为H18016，H18017，H18018），按2.3 项下方法制备供试品溶液，采用火焰法测定，分别采用德国耶拿AAS－ZEEnit700P 型、澳大利亚GBC SavantAA型原子吸收分光光度计，按2.1 项下条件测定。结果见表4。表明使用不同品牌仪器的含量测定结果稳定。

2.7 样品含量测定

取21 批样品，依法制备供试品溶液，按2.1 项下元素测定条件和2.2 项下微波消解程序升温条件测定样品中总铁的含量。结果见表5。

3 讨论

3.1 容量法问题和限度规定不严谨

1）试验方法。查阅现行部颁标准的起草说明，该标准采用的容量法主要参照了枸橼酸铁铵的含量测定方法，原理为枸橼酸铁铵加酸变成三价铁离子（Fe3＋），利用Fe3＋在酸性条件下氧化碘化钾析出碘，用硫代硫酸钠溶液滴定，以测定含量。由于肝精补血素口服液为复方制剂，该方法并不完全适用于该剂型的测定。由表3可见，同一批样品不同人员测定结果差距大，结论也不同，易造成市场监督抽验出现争议。分析原因，滴定终点判断是颜色由黄紫色变成淡黄色（标准规定滴定至紫色消失），由于辅料和其他药味的干扰（该药品性状为暗红色的澄清液体），造成该滴定终点不易判断，导致测定结果因人而异。同时，3 家生产企业均反映样品在保质期内，枸橼酸铁铵可能会逐渐与其他辅料发生反应，形成其他价态，导致部分消耗，而原容量法的前处理并不能完全将所有价态的铁转化为Fe3＋，易造成近效期的样品含量测定结果进一步降低。

表4 不同品牌原子吸收分光光度计测定结果比较（mg／mL）Tab.4 Comparison of results between two brands of atomic absorption spectrophotometers（mg／mL）

表5 样品总铁含量测定结果（mg／mL）Tab.5 Results of content determination of total iron in the samples（mg／mL）

2）限度规定。标准规定限值为每1 mL 不得少于1 mg，按照检验结果修约，其范围为0.6 ～1.4 mg，范围过宽，同样会导致市场监督抽验出现争议。

3.2 投料问题

经调研生产企业发现，企业在实际生产中购进的枸橼酸铁铵中总铁的含量为20.5% ～22.5%，根据处方投料5 g 枸橼酸铁铵制成成品，成品中总铁的含量应为每1 mL 含1.025 ～1.125 mg。由于原标准存在3.1 项下的2 个问题，3 家生产企业在实际生产中，为避免产品总铁含量低于限度规定或避免争议，实际投料均为6 ～8 g，投料量超出处方规定的20% ～60%。

3.3 样品前处理方式考察和方法选择

根据投料量折算，样品需稀释500 倍，考察了直接稀释法、直接稀释加离子释放剂（氯化锶）法、湿法消解及微波消解法。结果表明，直接稀释法和直接稀释加离子释放剂（氯化锶）法，上机样品溶液尽管有机物含量低于1%，但由于样品是直接稀释，口服液中的糖分和其他辅料会干扰测定，造成测定数据不稳定，同时回收率过高，超出相关技术要求的规定，故不采用上述两法。湿法消解和微波消解法回收率均较理想，可采用该两法，考虑到湿法消解时间较长及所需试剂量较多，故优先选择微波消解法。总铁的测定现行方法主要有容量法、原子吸收火焰法、电感耦合等离子体－质谱法，考虑到铬超标药用胶囊事件后，各药品生产企业均配备了原子吸收分光光度计及微波消解仪，而电感耦合等离子体－质谱仪价格昂贵，使用成本偏高，故优先选用微波消解－原子吸收火焰法测定总铁含量。