60Co－γ 射线辐照灭菌对蜈蚣药粉品质的影响研究*

韩振明，关永霞，张 微，马 云，张贵民

（1. 鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006； 2. 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；3. 鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276006）

蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch 的干燥体，可息风镇痉、通络止痛、攻毒散结［1］，含有蛋白质、多肽、氨基酸、脂肪酸、多糖、微量元素等成分，具有抗肿瘤、镇痛、调节免疫、抑菌［2－6］等多种药理活性。蜈蚣生粉入药的中药处方制剂有多种，如脉络舒通丸、蝎蜈颗粒、蜈蚣败毒饮等，可用于多种疾病的治疗［7－10］。动物药材中的多肽、多糖等成分为微生物的繁殖提供了良好的生长环境，在加工、贮存过程中极易霉变，导致微生物含量超标，对临床的用药安全产生极大威胁，故中药处方制剂生产过程中药材灭菌的前处理尤为重要。现阶段，已有较多射线相关研究及应用，60Co－γ 射线多见于医学诊断及工业探测领域［11－12］，在食品药品的消毒灭菌中也有应用。60Co－γ 射线辐照灭菌法已应用于多种药材饮片的灭菌，高效，操作简单，穿透力强，速度快，可用于含热敏性成分药材的灭菌，具有灭菌彻底、无污染、无残留等优势。有人对多种药材进行60Co－γ 射线辐照灭菌法的可行性研究，如黄精、地黄、龙胆、黄芩、天南星、蝉蜕等［13－14］。刘滨思等［15］曾考察3 种灭菌方法对蜈蚣有效成分及沙门菌灭菌效果的影响，与干热灭菌、湿热灭菌相比，60Co－γ 射线辐照灭菌效果最好，但未对蜈蚣药粉辐照灭菌剂量进行优化研究。本研究中探讨了不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌对蜈蚣药粉8 种核苷成分及微生物指标的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与菌种

仪器：Agilent 1100 型高效液相色谱（HPLC）仪［包括二极管阵列检测器（DAD）、四元低压梯度泵、Agilent Open Lab 型色谱工作站，安捷伦科技有限公司］；Toledo LE204E 型电子分析天平（精度为十万分之一），01193－YP601N 型电子分析天平（精度为万分之一），均购于梅特勒－托利多集团；KQ5200E 型数控超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）；JD－CJ－1A 型超净工作台（苏州金大净化工程设备有限公司）；BJPX－200 型生化培养箱（济南翔天生物科技有限公司）；粉碎机；80 目药筛。

试药：蜈蚣购于亳州药材市场，经鲁南厚普制药有限公司质检中心高级工程师范建伟鉴定为正品，符合2015 年版《中国药典（一部）》来源规定；乙腈（批号为20185187），甲醇（批号为20193307），均为色谱纯，购于赛默飞世尔科技有限公司；异丙醇（色谱纯，批号为181217871G），磷酸（色谱纯，批号为191115647F），甲醇（分析纯），均购于南京化学试剂股份有限公司；有机滤头（爱西默科技有限公司，孔径为0.22 μm）。

菌种：胰酪大豆胨琼脂（批号为HB4114－04），沙氏葡萄糖琼脂（批号为HB025381），均购于青岛海博生物技术有限公司；大肠埃希菌（菌号为43094，成都生物制品研究所）；乙型副伤寒沙门菌（菌号为50699，中国医学细菌保藏管理中心）。

1.2 方法

辐照灭菌方法：将蜈蚣药材粉碎，过80 目药筛，保存，备用。称取药粉15 份，每份200 g，以无菌自封袋密封，分别编号1 ～15 号，分为5 组进行试验，每组3 份。参考原国家食品药品监督管理总局《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015 年第86 号）及文献［16］，得知中药最大总体平均辐照剂量不超过10 kGy，故辐照试验设计如下。蜈蚣药粉1 ～3 号无操作，为阴性对照组（0 kGy60Co－γ 射线）；其余12 份（4 ～15 号）分别以4，6，8，10 kGy60Co－γ 射线进行动态辐照灭菌操作，为试验组；菌种活化培养为对照组。观察并记录试验组与对照组的药粉外观性状。

药典检查指标测定：照2015 年版《中国药典（一部）》药材蜈蚣项下［1］要求，对经不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌的蜈蚣药粉进行检查项测定，包括水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸溶性浸出物、重金属及有害元素、黄曲霉毒素等。

微生物限度检查：照2015 年版《中国药典（四部）》通则1105 及通则1106［17］，对经不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌的蜈蚣药粉进行微生物限度检查，包含需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数等，同时按上述检查方法对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌进行活化及接种培养计数。

化学成分含量测定：张琪等［18］的研究中，采用HPLC－DAD 法对经不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌的蜈蚣药粉的化学成分进行定量分析，包括胞嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脱氧肌苷、胸苷8 种。以上8 种核苷类成分分离良好，在一定质量浓度内的线性关系良好（r ＞0.999），精密度试验、重复性试验、稳定性试验结果的RSD 均小于3.0%，准确度试验在95% ～102%范围内。

1.3 统计学处理

采用Excel 软件和SPSS 19.0 统计学软件分析，包括方差分析（ANOVA）和直观分析。

表1 不同60Co－γ 射线辐照剂量的蜈蚣药粉药典检查指标测定结果Tab.1 Determination of inspection indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder（according to the Chinese Pharmacopoeia）sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation

2 结果

2.1 灭菌后性状

经观察，各批次蜈蚣药粉灭菌前后外观性状均无明显差异，药粉显灰绿色，有刺鼻腥臭味；5 个试验组蜈蚣药粉的形态、颜色、气味均一稳定。

2.2 药典检查指标测定结果

结果见表1 和表2。可见，各试验组蜈蚣药粉中水分、总灰分、酸不溶性灰分、总黄曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金属及有害元素各指标均符合2015 年版《中国药典（一部）》项下限度要求，各试验组间无显著差异（P ＞0.05）。

2.3 微生物限度检查结果

结果见表3。可见，未经60Co－γ 射线辐照的阴性对照组需氧菌总数为10 000 cfu／g，霉菌和酵母菌总数为120 cfu／g，耐胆盐革兰阴性菌个数小于10 cfu／g，未检出大肠埃希菌与沙门菌，其中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数远超过2015 年版《中国药典（四部）》标准（需氧菌总数不得超出3 500 cfu／g，霉菌和酵母菌总数不得超出50 cfu／g）；经4 kGy 以上辐照剂量灭菌的试验组需氧菌总数急剧降低，较阴性对照组减少了87%，需氧菌总数与辐照剂量呈负相关，随着辐照剂量的增加，需氧菌总数迅速减少，辐照剂量增加至10 kGy 时，需氧菌总数降至小于10 cfu／g；霉菌和酵母菌总数经4 kGy60Co－γ 射线辐照灭菌后总数比阴性对照组降低了25%，继续增加辐照剂量，霉菌和酵母菌总数持续降低，最后降至辐照剂量为8 kGy 时的10 cfu／g 以下；2015 年版《中国药典（四部）》要求蜈蚣药材中耐胆盐革兰阴性菌不得大于100 cfu／g，5 个试验组中，耐胆盐革兰阴性菌含量均小于10 cfu／g，符合要求。此外，试验过程中无论是否接受60Co－γ 射线辐照灭菌，均未检出大肠埃希菌与沙门菌，由菌种活化后在相同培养条件下接种培养的样品可检出大肠埃希氏菌与沙门菌（见表3 中对照试验数据）。

表3 不同60Co－γ 射线辐照剂量的蜈蚣药粉卫生学指标测定结果（cfu／g）Tab.3 Determination of hygienic indexes of Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（cfu／g）

依照非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物标准，经6 kGy 以上辐照剂量灭菌的试验组的微生物限度均符合含生药粉口服固体制剂卫生学标准。综上分析，并考虑工业生产中的灭菌成本问题，8 kGy 及8 kGy 以上剂量辐照灭菌效果最佳。

表4 不同60Co－γ 射线辐照剂量的蜈蚣药粉8 种核苷类成分含量测定结果（n ＝3）Tab.4 Determination of eight nucleosides in Scolopendra subspinipes mutilans medicinal powder sterilized by different doses of 60Co－γ－ray irradiation（n ＝3）

2.4 化学成分测定结果

结果见表4。可见，不同试验组蜈蚣药粉中次黄嘌呤和黄嘌呤含量明显高于其他6 种核苷类成分，15 个批次样品中均含有上述8 种成分，各试验组间含量无显著差异（P ＞0.05）；且不同辐照剂量5 个试验组中，8 种核苷类成分总含量均处于同一水平，且无显著差异（P ＞0.05）。

3 讨论

本试验中探讨了不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌对蜈蚣药粉质量的影响，结果5 个试验组中蜈蚣药粉形态、颜色、气味均一稳定；水分、总灰分、酸不溶性灰分、黄曲霉毒素、酸溶性浸出物含量、重金属及有害元素各指标各试验组间均无显著差异；5 个试验组样品中均含有胞嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′－脱氧肌苷、胸苷8 种核苷类成分，不同辐照剂量5 个试验组中8 种核苷类成分总含量均处于同一水平，差异不显著，表明辐照灭菌对蜈蚣药粉中活性成分的含量无影响。

不同剂量60Co－γ 射线辐照灭菌对蜈蚣药粉中微生物数量影响极为明显，各试验组间需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数差异显著；辐照剂量越高，微生物限度指标检查结果越低，6 kGy 以上辐照剂量灭菌的试验组微生物限度符合含生药粉口服固体制剂卫生学标准。

综上所述，60Co－γ 射线辐照灭菌对蜈蚣药粉综合品质评价中卫生学指标有优化提升作用，其他方面品质如理化性质、成分含量等方面无显著影响。因此，60Co－γ射线辐照灭菌可作为蜈蚣药材的灭菌方法进行推广；在保证灭菌效果符合要求的前提下，综合工业生产中灭菌成本及辐照安全性问题，在辐照剂量0 ～10 kGy 范围内，8 kGy 及8 kGy 以上剂量辐照灭菌效果最佳。因此，蜈蚣药材饮片辐照灭菌最佳剂量为8 ～10 kGy。