蓖麻种子萌发和幼苗生长对重金属Zn2+的胁迫响应※

●尹明达 罗 蕊 包春光 孟祥越 孙 雪 王凡浩 贾崇宁 李正彩 张圆圆 黄凤兰,3,4,5,6,7※※

（1.内蒙古民族大学生命科学与食品学院 内蒙古 通辽 028000；2.通辽市农畜产品质量安全中心 内蒙古 通辽 028000；3.蓖麻育种国家民委重点实验室 内蒙古 通辽 028000；4.内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心 内蒙古 通辽 028000；5.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室 内蒙古 通辽 028000；6.内蒙古自治区蓖麻产业协同创新中心 内蒙古 通辽 028000；7.蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心 内蒙古 通辽 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）属双子叶植物纲、大戟目、大戟科、蓖麻属草本植物[1]，是重要的油料作物，在生态修复、医药前体开发、生物防治等领域具有很高的开发利用价值[2]。蓖麻耐旱、耐瘠薄，适应性强，不与粮棉争地，地边拐角均可栽植，因此我国的蓖麻资源十分丰富且分布广泛[3]。

锌是所有生物体必需的元素，它密切参与植物体内的各种生命代谢活动[4]。对于植物来说，锌有利于植物生长素的形成，还有增强抗逆性的作用。植物缺锌会导致植株短小、叶片的扩展与伸长受到限制、节间短[5]，但并不是说锌的浓度越高植物生长就越好。对植物幼苗来说，吸取过量的锌会明显降低叶绿素含量，且会严重影响植物根和叶片的生长。现阶段，锌矿的开采、镀锌、仪器仪表及机械制造等工业活动，各种化工厂排放的工业废水中都含有大量的Zn2+，燃煤的烟尘中的锌含量也常超标，会对土壤、水源和大气造成严重污染[6]。锌污染会破坏土壤的结构与功能；还会影响土壤的理化性状，严重时还会威胁土壤的自然生产力[7]。被锌污染的土壤中微生物的种类和数量显著降低，土壤酶的活性被破坏[8]。锌对水的污染更加严重，因为锌对水生动物的毒性更大，如用含锌污水浇灌作物，会造成污染范围扩大。

蓖麻对各种重金属离子有着很高的耐受性，而锌是蓖麻生长必不可少的微量元素，浓度过高的Zn2+又会对蓖麻产生胁迫影响。研究蓖麻对Zn2+的耐受程度及其耐受原因，对治理锌污染土壤具有重大意义，且为后续深入开展蓖麻抗逆性研究奠定了基础。本研究以‘2129’品系蓖麻为材料，对该种蓖麻种子及幼苗测定各项生理指标，从而研究蓖麻种子萌发和幼苗生长对Zn2+的耐受程度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料‘2129’品系的蓖麻种子，由内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室提供。

1.1.2 设备与器具设备：各种型号移液器、分析电子天平EP214Dcd、高速大容量低温离心机（multifuge X3）、小型高速低温离心机（eppendorf Centrifuge 5424 R）、 酶 标 仪（infinite M200 pro）、HVE-50 型高温高压灭菌锅、超低温冷冻冰箱（Thermo Scientific Forma 702）。

器 具：1.5mL、4mL、15mL 离 心 管，30mL玻璃试管，50mL、100mL、500 mL、1 000mL 容量瓶，100mL、1 000mL 烧杯，玻璃棒，石英管，1 300mL 圆形塑料培养盒，直径100mm 陶瓷研钵及钵杵。

1.1.3 试剂七水合硫酸锌（Z nSO4·7H2O）、液氮、愈创木酚、30% H2O2、20% TCA、0.5%TBA、PBS（pH7.8，50mm）、0.1mol/L H2O2、2mm NADPH、10mm GSSG。

1.1.4 其他干净的蛭石、干净无污染的黄土。

1.2 试验设计

准备饱满健康的蓖麻种子若干，蛭石若干，黄土若干，1 300mL 圆形塑料培养盒17 个，滤纸。将圆形塑料培养盒进行121℃、20min 高压灭菌，取出后在每个盒盖中间部位打若干直径为15mm 的孔洞并将滤纸粘在上面，将孔洞全部遮住。选出1 700 粒蓖麻种子，平均分成17 份。在培养盒中加入大约150g 蛭石，将17 份种子分别均匀地撒在17 个培养盒的蛭石上，再用大约150 g 蛭石将其覆盖。用无水硫酸锌配制不同浓度的ZnSO4溶液，分别为120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L、1 560mg/L、1 800mg/L、2 040mg/L、2 280mg/L，每种浓度的溶液800mL。向15 个培养盒中浇入不同浓度硫酸锌溶液，并做好标记，剩余两个培养盒中各加入800mL 清水，作为种子对照和栽种幼苗预备。将17 个培养盒放在25℃有光照的温室中培养72 h。后用清水筛洗出来，并按不同处理分开摆放在干净的桌面上。

在最后一个清水培养的培养盒中取根长、大小一致的40 粒蓖麻萌发种子，播种至装有大约1.5kg/盆黄土的花盆中，使用清水与浓度120mg/L至2 280mg/L 的ZnSO4溶液分别对幼苗进行培养。

1.3 测试方法

1.3.1 种子形态学观察对上述经过清水与浓度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培养过的蓖麻种子进行观察，并拍照保存。

1.3.2 种子发芽率统计取上述清水与浓度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培养过的蓖麻种子，统计每份种子的萌发数量与未萌发数量，记录数据并计算不同浓度处理后的种子发芽率。

1.3.3 种子生理指标测定膜脂受损程度以及植物的抗逆性通过检测MDA 含量来测定[9]。蓖麻种子中MDA 含量的测定原理参照张清航[10]论文中的原理。公式：

注：V1为提取液总体积（4mL）；V2为测定用的酶液体积（1mL）；W为样品鲜重（0.4 g）。

CAT 活性的测定。过氧化氢酶主要用于催化过 氧化氢进行反应[11-12]。对CAT 活性的测定及其原理参照Gill S S、Quan L J 与杨节[13-15]的论文。以每分钟 OD 值变化（减小）0.1为1个酶活性单位（U）。公式：

注：ΔA240为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（3min）；V1为提取酶液总体积（4mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.2mL）。

GR 的测定。对谷胱甘肽还原酶活性的测定参照刘振玉[16]论文中所述的GR 的特性来进行测定与计算。按每克样本每分钟催化1μmol NADPH氧化为1 个酶活单位（U）。公式：

注：ΔA340为实验组在反应时间内吸光度的变化；ΔA空白为空白组在反应时间内吸光度的变化；ε 为NADPH 摩尔消光系数6.22×103L·mol-1·cm-1；d为比色皿内径（5.85mm）；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（2min）；V1为提取酶液总体积（4mL）；V3为反应体系总体积（2.25mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.3mL）。

P OD 的测定。POD 活性的测定原理参照GARCíA-PONCE Á L[17]等人的论文。以每分钟OD值变化（升高）0.01 为1 个酶活性单位（U）。公式：

注：ΔA470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（3min）；V1为提取酶液总体积（4 mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.02mL）。

1.3.4 幼苗形态学观察分别取培养7d、15d、21d 的蓖麻幼苗的根与叶片，用清水洗净并进行拍照对比观察，清洗时注意不要损坏根茎与叶片。

1.3.5 幼苗生理指标测定叶片的生理指标测定方法参 照1.2.1 中对 种 子MDA、CAT、GR、POD 四个指标的测定，测定材料为四叶期处理后的新鲜叶片。

2 结果与分析

2.1 种子萌发对Zn2+的胁迫响应

对用清水与不同浓度ZnSO4溶液处理3d 后的种子进行观察，蓖麻种子发芽率统计结果见表1。由表1 可以看出，用不同浓度Zn2+处理的蓖麻种子的萌发程度与清水组相比差异显著，但未表现出明显规律，在Zn2+浓度达到960 mg/L 时，发芽率达到最高且显著性差异最大。

表1 蓖麻种子发芽率统计结果

对种子进行不同浓度的Zn2+处理与培养，3d后，蓖麻种子根长统计结果见表2，蓖麻种子根粗统计结果见表3。

由表2 可以看出，与清水组相比，当Zn2+浓度在480mg/L 以下时，种子根长逐渐增长；在Zn2+浓度超过480mg/L 后差异显著，但未表现出明显规律；在Zn2+浓度达到960mg/L 时，蓖麻种子的根长达到最高值41.32mm。由表3 可以看出，根粗则仅在部分浓度处理时差异显著且未出现明显规律，但在Zn2+浓度大于1 320mg/L 后，根粗数值全部低于正常数值，但没有出现蓖麻种子死亡，证明蓖麻对锌具有很高的耐性。此结果与吕冬梅[18]的研究Zn2+结果相吻合。

表2 蓖麻种子根长统计结果

表3 蓖麻种子根粗统计结果

分别用480mg/L、720mg/L、960g/L、1 200mg/L、1 560mg/L、2 040mg/L 的ZnSO4溶液对蓖麻种子进行培养，如图1～7，图中A 为处理后萌发的种子，B 为处理后未萌发的种子。

从图1～4 可以看出，与清水组相比，Zn2+浓度达到720mg/L 时，蓖麻种子表面开始出现黄色斑块；Z n2+浓度达到960mg/L 时斑块明显减少；Zn2+浓度在1 080 ～1 320 mg/L 之间时，部分种子主根明显增长，但侧生根数量减少且黄色斑块少量增加；Zn2+浓度大于1 320mg/L 时，种子表面黄色斑块增加，主根长度减小，几乎无侧生根。

由表1 可以看出，用不同浓度Zn2+处理的蓖麻种子与清水组相比差异显著，但未表现出明显规律，且在Zn2+浓度达到960 mg/L 时,显著性差异最大。同时，在处理浓度大于960mg/L后，部分数值大大低于正常数值，因此，本实验选用960mg/L 浓度处理的种子进行生理指标测定。

按照1.3 中所述方法对培养后的种子进行生理指标测定，种子中MDA 含量、CAT 活性、GR活性和POD 活性的测定结果，见图8。

由图8 可以看出，与清水培养后的种子相比，不同Zn2+浓度处理的种子MDA 含量、CAT和POD 活性都低于对照，GR 活性则远远高于对照。

2.2 幼苗生长对Zn2+的胁迫响应

根据各处理下蓖麻种子萌发情况，选用Zn2+浓度为960mg/L 的ZnSO4溶液对蓖麻幼苗进行培养，分别在7d、15d、21d 时对幼苗的整体、叶片及根部进行观察并分析。结果见图9、图10、图11。图A 为处理后的幼苗植株形态，图B 为处理后的幼苗叶片形态，图C 为处理后的幼苗根形态；CT 为实验组，CK 为对照。

可以发现，幼苗植株在培养7d 时与对照相差不大，随着时间增加，植株越来越小；幼苗根长在培养7d 时比对照长约1/3，到15d 时根长严重缩短，到21d 时，侧生根明显减少且主根呈现不健康的棕红色；幼苗叶片在培养7d 时与对照无明显差异，到15d 时叶片开始褪绿并出现黄色斑点，到21d 时，叶片严重褪绿，叶面大幅度缩小且黄色斑块增多。但即使在该浓度下处理21d，幼苗仍未出现死亡，证明蓖麻对Zn2+具有很强的耐性。

根据1.3中所述方法对培养7d、15d、21d 后的幼苗分别进行生理指标测定，幼苗MDA 含量、CAT活性、GR 活性、POD 活性的测定结果，见图12。

由图12 可以看出，用Zn2+浓度为960mg/L的ZnSO4溶液处理的幼苗MDA 的含量与POD 活性低于对照很多，而CAT 与GR 活性则高出对照很多，其中用Zn2+浓度为960mg/L 的ZnSO4溶液处理的幼苗的POD 活性与对照相差最多。且在整个实验过程中，没有出现幼苗死亡现象，证明蓖麻对Zn2+的耐受程度极高。

3 讨论

随着锌污染日益增加，大量含锌污染物以尘、烟等形式排放到环境中，并最终通过土壤、水源、植物吸收和积累对人类健康造成威胁[19]。高效的处理锌污染逐渐成为目前急需解决的问题。植物对重金属的耐受程度与重金属在其体内的积累、转运等因素密切相关[20]。重金属胁迫不但会影响植物中叶绿素的合成，还会影响植物体内的正常代谢，最终导致植物体中各物质含量的改变[18]。相关分析表明，Zn2+在植物体内积累超出阈值，会对植物造成毒害，抑制植物生长发育，严重可能造成植物死亡[21]。蓖麻根系发达，抗逆性较强，对Zn2+有很大的耐受性，可以通过吸收和代谢实现对土壤中锌的吸附、净化、固定[22]。Rosselli[23]等的研究表明，植物中Zn2+的转运能力较好，大部分向地上部分运输。抑制生长和减少植株生物量是植物对Zn2+胁迫的普遍响应[24，25]。本实验表明，蓖麻吸收小于960mg/L 浓度的Zn2+会促进其生长，而吸收超过960mg/L 浓度的Zn2+则会对蓖麻产生毒害，抑制其生长，这与Rosselli的研究结果一致。与蓖麻相比，臭椿仅能适应在Zn2+浓度不超1 000mg/L 的土壤中生存，法桐对Zn2+的耐受性更弱，不适合种在锌污染土壤中[26]。而本实验中所用最高浓度Zn2+（2 280mg/L）处理的蓖麻仍未出现死亡现象，证明相比于其他植物，蓖麻对Zn2+耐受性更强。

4 结论

在种子萌发阶段，随着Zn2+浓度升高，蓖麻种子的发芽率虽然差异显著，但无明显趋势，在Zn2+浓度达到960mg/L 时达到最大发芽率且显著性差异最大；根长与根粗显示出先增后降，再增再降的趋势；在生长过程中即使Zn2+浓度达到2 280mg/L，种子仍未出现死亡现象，证明蓖麻对锌有很高的耐受程度；在Zn2+浓度达到960mg/L 时，蓖麻种子中吸收了过量锌，影响了其生长。在幼苗生长阶段，用Zn2+浓度为960mg/L 的ZnSO4溶液处理幼苗，随着处理时间的增加，幼苗植株越来越矮小，根长缩短，叶片越来越小且褪绿越来越严重；生理指标与对照相比证明在Zn2+浓度为960mg/L 的ZnSO4溶液培养下，蓖麻幼苗吸收的Zn2+逐渐增多，最终超过阈值，对蓖麻苗产生了严重伤害，影响其生长。但在整个实验过程中，处理后的种子和幼苗均未出现死亡现象，证明蓖麻对Zn2+有极高的耐受性。