基于网络药理学分析牡丹皮-赤芍治疗银屑病的作用机制*

陈广山，李玲玲，白春晓

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

银屑病是一种自身免疫相关的炎症性皮肤病，因其容易反复发作，迁延难愈，严重影响患者的生活质量。银屑病的发病机制尚不清楚，现代研究认为可能涉及遗传、感染、免疫、精神等多方面因素[1]。中医将银屑病称之为“白疕”，在《证治准绳》中曾记载：“遍身起如风疹、疥、丹之状，其色白不痛，但搔痒，抓之起白疕。”[2]在治疗上将银屑病分为血热证、血燥证、血瘀证3型，其中血热证最为常见，因此清热凉血是治疗银屑病的核心思路之一[3]。

牡丹皮-赤芍是临床上常用的药对。牡丹皮有清热凉血，活血化瘀的功效，《本草经疏》中记载：“牡丹皮，其味苦而微辛，其气寒而无毒，辛以散结聚，苦寒除血热，入血分，凉血热之要药也。”《药品化义》中曰：“赤芍，味苦能泻，带酸入肝，专泻肝火。盖肝藏血，用此清热凉血。”两者都是清热凉血的常用药物。有研究统计了327首治疗银屑病的方剂，牡丹皮、赤芍的用药频次均位于前列，是治疗银屑病的要药[4]。但其治疗银屑病的具体作用机制仍不清楚。

网络药理学是基于大数据技术的一门新兴学科，主要涉及系统生物学，生物信息学以及药理学。利用网络药理学大数据的特性，可以对中药复方的作用机制进行预测，为基础研究提供思路[5]。本研究通过网络药理学的方法筛选出牡丹皮、赤芍的成分群，通过中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）、The Human Gene Database（GeneCards）等数据库查找牡丹皮-赤芍治疗银屑病的相关靶标，构建“中药-靶点-疾病”的网络，最后筛选出药物治疗疾病的关键通路，为进一步研究牡丹皮-赤芍治疗银屑病的作用机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 牡丹皮-赤芍有效成分及其作用靶点的筛选方法 将牡丹皮、赤芍分别作为关键词，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18作为筛选标准，在 TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）平台上搜索两种药物的有效活性成分，并进一步提取这些成分所对应的作用靶点。

1.2 银屑病的靶点检索与收集方法 依托GeneCards（https：//www.genecards.org）平台，以“Psoriasis”为关键词进行检索，筛选疾病的相关靶点。

1.3 明确牡丹皮-赤芍治疗银屑病的潜在作用靶点的方法 为明确牡丹皮-赤芍作用靶点与银屑病的疾病靶点之间的关系，利用ClusterProfiler R软件绘制韦恩图，得到两者之间的交集，即牡丹皮-赤芍治疗银屑病的潜在作用靶点。

1.4 构建蛋白质相互作用（PPI）网络的方法 依托STRING平台（https：//string-db.org），将牡丹皮-赤芍及银屑病的共同靶点上传，构建靶蛋白相互作用网络。

1.5 构建药物-有效成分-靶点-疾病网络的方法 利用Cytoscape3.7.2软件，上传药物、有效成分、药物与疾病共同作用靶点、疾病信息构建药物-有效成分-靶点-疾病网络。得到药物与疾病靶点相互作用关系。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路分析的方法 为进一步研究牡丹皮-赤芍治疗银屑病的生物学过程，利用ClusterProfiler R软件平台对牡丹皮-赤芍及银屑病的共同作用靶点进gene ontology（GO）功能富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）代谢通路富集分析，并进行可视化处理，以探讨牡丹皮-赤芍治疗银屑病的相关生物学过程。

2 结果

2.1 牡丹皮-赤芍有效成分及其作用靶点的筛选 利用TCMSP平台，分别以牡丹皮、赤芍为关键词检索两种中药的有效成分，并以OB≥30%，DL≥0.18为标准进行筛选，共获得40个有效化合物，其中牡丹皮11个，赤芍29个，去除重复成分后共获得37个有效成分，以OB值大小进行排序，列出前20位有效成分，见表1。继续利用TCMSP平台，检索出37个有效成分所对应的作用靶点，去除重复后共得到178个作用靶点。

表1 牡丹皮-赤芍有效成分信息表Tab.1 Active ingredient information table of cortex pcortex moutan-radix paeoniae rubra

2.2 银屑病相关靶点 以“Psoriasis”为关键词在GeneCards进行检索，筛选出银屑病的相关靶点3 729个。

2.3 牡丹皮-赤芍治疗银屑病的潜在作用靶点 使用ClusterProfiler R软件绘制韦恩图，得到牡丹皮-赤芍治疗银屑病的潜在作用靶点112个，见图1。

图1 牡丹皮-赤芍治疗银屑病靶点的韦恩图Fig.1 Wayne diagram of therapeutic target of pcortex moutan-radix paeoniae rubra on psoriasis

2.4 PPI网络 将牡丹皮-赤芍与银屑病的共同靶点上传至STRING平台，得到靶蛋白PPI网络，见图2。图中各节点代表靶蛋白，连线代表相互之间的作用，连线越多的节点，越有可能是牡丹皮-赤芍治疗银屑病的关键靶点，经过统计得到各节点的连线数量，见图3，排名前5位的分别是JUN、AKT1、RELA、丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、白介素（IL）-6。

图2 牡丹皮-赤芍与银屑病蛋白质相互作用网络图Fig.2 Network diagram of protein interaction between pcortex moutan-radix paeoniae rubra and psoriasis

图3 PPI网络中各节点连线的数量Fig.3 Number of connections of each node in the PPI network

2.5 构建药物-有效成分-靶点-疾病网络 将药物、有效成分、药物与疾病共同作用靶点、疾病信息上传至Cytoscape3.7.2软件，得到药物-有效成分-靶点-疾病相互作用网络，见图4。

图4 药物-有效成分-靶点-疾病相互作用网络图Fig.4 Network diagram of drug-active ingredient-target-disease interaction

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路分析 使用ClusterProfiler R软件平台，将牡丹皮-赤芍治疗银屑病潜在的112个作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析显示牡丹皮-赤芍治疗银屑病涉及134个生物学过程（P＜0.05），将排名前20的条目进行可视化处理，绘制柱状图，见图5。其中富集较为集中的生物学过程有细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、四吡咯结合、RNA聚合酶II转录因子结合、受体配体活性等。KEGG通路分析经筛选共得到155条通路（P＜0.05），将排名前20的条目进行可视化处理，绘制柱状图，见图6。其中富集较多的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、血流剪切应力和动脉粥样硬化通路、IL-17信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路等。

图5 牡丹皮-赤芍作用靶点的GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis of pcortex moutan-radix paeoniae rubra target

图6 牡丹皮-赤芍作用靶点的KEGG富集分析通路图Fig.6 KEGG enrichment analysis pathway of pcortex moutan-radix paeoniae rubra target

3 讨论

中国银屑病的发病呈快速增长趋势，因其治疗困难，给患者的生理和心理都造成了极大的困扰[6]。西医学认为银屑病是一种免疫相关的慢性炎症性疾病，与炎症细胞的活化，角质形成细胞的增殖及血管增生迁移有关[7-8]。中医在长期的实践当中，形成了“从血论治”治疗银屑病的思路[9]。牡丹皮-赤芍药对既能清热凉血，又可活血化瘀，是中医治疗银屑病的要药[10]。

研究通过网络药理学的方法，共获得牡丹皮-赤芍治疗银屑病的有效成分37个，作用靶点178个。经过进一步筛选，得到治疗银屑病可能相关的化合物有芍药苷、槲皮素、鞣花酸、黄芩素、山奈酚、儿茶素、β-谷甾醇、豆甾醇等。现代研究显示，芍药苷既有抗炎作用，又有免疫调节作用[11]。芍药苷还可通过p38/MAPK通路抑制IL-22的表达，从而对银屑病起到治疗作用[12]。槲皮素、β-谷甾醇既可以抑制IL-6、TNF-α等炎症因子的释放发挥抗炎作用，又可以抑制淋巴细胞活化和增殖起到免疫调节作用[13-14]。鞣花酸可以通过降低丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）磷酸化，抑制核因子κB（NF-κB）活化减轻炎症反应[15]。黄芩素可以通过抑制核因子的活性和细胞因子的分泌、释放发挥抗炎的作用[16]。山奈酚可以通过调节细胞周期，介导细胞的凋亡来实现免疫调节作用[17]。儿茶素在药理上有抗菌和抗病毒的功效[18]。豆甾醇亦有抗炎的作用，研究发现其可以减轻由免疫球蛋白E诱导的皮肤过敏反应，可以显著减少皮肤的增厚和炎性细胞浸润，在治疗皮肤疾病方面很有潜力[19]。

牡丹皮-赤芍与银屑病的共同作用靶点有112个。通过PPI网络分析，发现关键靶点为JUN、AKT1、RELA、MAPK1、IL6、FOS。JUN 是 1 号染色体的基因，FOS基因的表达可以调节细胞增殖、分化，由JUN和FOS组成的激活蛋白1（AP-1）是人体内一类重要的核转录因子，在炎症反应和免疫系统方面有重要的调节作用。T淋巴细胞在银屑病的发病中起重要的作用[20]。AP-1蛋白可调节初始T细胞向效应T细胞的分化，从而影响免疫反应和炎症过程[21]。AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对细胞的增殖、分化有调节作用，同时参与炎症反应的调节，多种恶性肿瘤的发生与其异常活化有关[22]。RELA是NF-κB蛋白家族成员之一，NF-κB是一种重要的转录因子，主要参与炎症反应、免疫调节以及淋巴细胞的增殖、分化、凋亡等。NF-κB信号通路调控失衡可以诱发机体感染、自身免疫性疾病、自身炎症性疾病和肿瘤等[23]。MAPK1通路可以参与中性粒细胞的活化影响炎症反应的过程[24]。IL-6与银屑病关系密切，在银屑病皮损中，多种细胞可以高表达IL-6，比如树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞等，IL-6可通过导致调节性T细胞/辅助性T细胞17（Treg/Th17）细胞失衡，从而导致银屑病的发生发展。同时，银屑病患者血清中IL-6水平也会显著升高，在经过治疗后，患者血清中IL-6水平显著下降，这可以作为治疗银屑病有效性的指标之一[25]。

对牡丹皮-赤芍与银屑病的共同作用靶点进行GO功能富集，涉及的生物学过程有细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、受体配体活性等，说明这些过程在牡丹皮-赤芍治疗银屑病中起到了关键作用。通过KEGG富集分析，涉及到的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。现代研究显示，AGERAGE信号通路可能是银屑病中发病的重要机制之一，通过抑制该通路，可以减轻炎症反应，进而起到治疗银屑病的作用[26]。银屑病的发生伴有多种炎性因子的升高，这些炎性因子通过促进胰岛素抵抗、代谢异常以及内皮功能紊乱等多种生物学进程，参与动脉粥样硬化的发生[27]。IL-17可以促进多种细胞释放炎性因子，从而使银屑病加重，并且血清中IL-17水平与银屑病严重程度呈正相关[28]。TNF-α炎症通路是银屑病发病的关键通路之一，而且抗TNF-α的生物制剂在临床上治疗银屑病已取得了良好的效果。

本研究通过网络药理学的方法，发现牡丹皮-赤芍治疗银屑病是通过多种有效成分作用在多种靶点、多种通路的生物学过程实现的，体现了中药之间的相互协同作用，也为进一步研究牡丹皮-赤芍治疗银屑病的作用机制提供了理论基础。鉴于网络药理学的局限性，还需要通过更多的实验和临床数据来进一步验证牡丹皮-赤芍治疗银屑病的关键靶点和通路。