光棘球海胆体腔液调理素样分子的研究

娄 越，陈 丹，常亚青，丛玉婷，王连顺，李丹彤

( 大连海洋大学，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023 )

光棘球海胆(Strongylocentrotusnudus)，又称大连紫海胆，属棘皮动物门、海胆纲、球海胆科，为中国主要海胆类养殖经济物种[1]。作为我国可食用和药用的海胆种类之一，光棘球海胆的养殖相关问题逐渐成为试验研究的重点[2-3]。目前海胆养殖病害防治的主要方法是抗菌素治疗，但过度使用抗生素会导致细菌产生抗药性[4]。因此研究光棘球海胆免疫机制，有助于海胆类生物病害防治机理研究。

棘皮动物只有非特异性免疫系统，由体腔细胞和体液免疫因子组成，吞噬细胞为其中重要的一种[5]。机体内起到促进吞噬作用的物质总称为调理素，能够帮助吞噬细胞吞噬和清除抗原抗体[6]，构筑体内免疫防线。目前，已在贝类[7]、海星[8]、海胆[9]和海参[10]等水产养殖动物中证实了在病原体周围有促进吞噬作用的物质存在。麦康森等[11]在对仿刺参(Apostichopusjaponicus)体腔液的研究中发现，调理素样分子在机体受到免疫刺激时分子水平会增加。张颖等[12]在虾夷马粪海胆(Strongylocentrotusintermedius)体腔液中发现了分子质量为250.62 ku的调理素样分子。张扬等[13]在长牡蛎(Crassostreagigas)中分离出一种新型贝类调理素DCP，具有强烈的促进血淋巴细胞吞噬的作用。目前光棘球海胆体腔液调理素的相关研究较少。

笔者测定在不同反应基质中等量光棘球海胆吞噬细胞对不同处理的酵母细胞的吞噬率，比较分析从受调理酵母细胞和非调理酵母细胞以及光棘球海胆无细胞体腔液这3种成分中提取分离出来的样品的电泳结果，提取收集光棘球海胆无细胞体腔液调理素样分子并进行功能测定。对光棘球海胆调理素样分子的试验，有利于研究其免疫机制，为进一步实现光棘球海胆的病害防治和健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

光棘球海胆购于大连黑石礁早市，平均体质量(80.9±1.9) g，海水温度15～18 ℃，16头光棘球海胆于大连海洋大学重点实验室100 cm×50 cm×60 cm 30 L充气水槽中养殖7 d后进行试验，每日换水1次。

1.1.2 酵母细胞悬液[14]

将100 mg酵母悬于0.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，沸水浴加热30 min，磷酸盐缓冲液冲洗后4000 r/min离心10 min，过程中磷酸盐缓冲液的添加量需低于离心管的2/3，冲洗离心6次，磷酸盐缓冲液稀释至体积比为1∶90。

1.1.3 吞噬细胞

用注射器从新鲜光棘球海胆的围口腔内抽取7～8 mL体腔液加入离心管，再加入等体积的无菌海水后1000 r/min离心5 min，取其沉淀加入1 mL无菌海水稀释，显微镜观察确保有吞噬细胞存在，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.4 光棘球海胆无细胞体腔液、调理素样分子

用0.22 μm的滤膜过滤抽取出来的光棘球海胆体腔液至少5遍，取10 μL在显微镜下观察，直到吞噬细胞被全部过滤掉，即为光棘球海胆无细胞体腔液，放在4 ℃冰箱保存，用透析膜透析60 h，之后通过平衡过的葡聚糖G-200柱进行层析，收集调理素样分子。

1.1.5 酵母细胞吸附的无细胞体腔液、受调理的酵母细胞

3.5 mL酵母细胞悬液和3 mL无细胞体腔液混合，常温培养1 h，8000 r/min离心10 min,得到的沉淀是吸附了调理素的酵母细胞，上清液是经酵母细胞吸附过调理素的光棘球海胆无细胞体腔液。将下层沉淀换到小离心管中，再进行一次离心后得到受调理的酵母细胞。

1.2 方法

1.2.1 不同反应基质对光棘球海胆吞噬细胞吞噬活性影响的测定

试验分4组进行，前3组分别在2 mL光棘球海胆吞噬细胞里加2 mL磷酸盐等渗缓冲液、经酵母细胞吸附过的无细胞体腔液和光棘球海胆无细胞体腔液，每组各加入1 mL酵母细胞悬液；第4组在2 mL光棘球海胆吞噬细胞里加2 mL等渗缓冲液和1 mL受调理酵母细胞；4组均于常温培养2 h，多次振荡试管后，显微镜下观察并测定不同的反应基质里等量光棘球海胆吞噬细胞对不同处理的酵母细胞的吞噬率。每完成1次计数后再换1组海胆抽取体腔液，再重复上述试验2次。

吞噬率为100个吞噬细胞中吞噬酵母细胞数的百分比[15]。

1.2.2 样品的制备及SDS-PAGE分析

制备3种样品并进行SDS-PAGE分析[16]。制备出受调理酵母细胞所提取的里面含有调理素样分子成分的样品：0.5～1.0 mL磷酸盐缓冲溶液洗涤受调理酵母细胞后，加200 μL 1% 十二烷基硫酸钠(SDS)，在沸水浴加热5 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液；制备出非调理酵母细胞所提取的不含调理素样分子成分的样品：0.5～1.0 mL磷酸盐缓冲溶液洗涤非调理的酵母细胞后，加200 μL 1%十二烷基硫酸钠，在沸水浴加热5 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液；制备其中含有调理素样分子成分的光棘球海胆无细胞体腔液的样品。3种样品分别进行电泳后，染色1 h，清洗3次，最后加脱色液。

1.2.3 调理素样分子的纯化及SDS-PAGE分析

用截留分子量3.5 ku的透析膜将抽取出来的光棘球海胆体腔液在4 ℃冰箱透析60 h，每隔15 h换透析液1次，之后通过平衡过的葡聚糖G-200柱(1.6 cm×90 cm)进行层析[17]，3.0 mL/10 min流速加缓冲液洗脱，280 nm紫外分光检测，对峰值进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 调理素样分子功能的测定

分别加入2.0、1.5、1.0、0.5 mL等渗缓冲液，再分别加入0、0.5、1.0、1.5 mL经纯化的调理素样分子, 每支试管中再加1.0 mL吞噬细胞和1.0 mL酵母细胞悬液,15 min振荡1次，使其完全混匀，室温培养2 h，用显微镜测定吞噬率。

1.2.5 数据处理

采用SPSS 13.0软件进行t检验，结果表示为平均值±标准差，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同反应基质里光棘球海胆吞噬细胞的吞噬率

光棘球海胆吞噬细胞分别在等渗缓冲液、经酵母细胞吸附过无细胞体腔液、光棘球海胆无细胞体腔液对非调理的酵母细胞和在等渗缓冲液中对受调理的酵母细胞的吞噬率之比为1.00∶1.17∶2.00∶1.71，对照组与其他3个试验组均有极显著差异(P<0.01)，这表明光棘球海胆体腔液中可能存在某种调理素样分子，能够提高吞噬细胞吞噬活性，其中等渗缓冲液中光棘球海胆的吞噬细胞对受调理的酵母细胞的吞噬率是对非调理的酵母细胞的1.71倍，这可能是光棘球海胆体腔液的调理素样分子被吸附在酵母细胞表面，从而增强了吞噬作用(图1)。

图1 不同反应基质吞噬细胞的吞噬率Fig.1 The rate of phagocytosis in different reaction media 1.PBS等渗缓冲溶液+非调理酵母细胞； 2.经酵母吸附的无细胞体腔液+非调理酵母细胞； 3.无细胞体腔液+非调理酵母细胞； 4.PBS等渗缓冲溶液+受调理酵母细胞. 1.the PBS isotonic buffer + no regulating yeast cells； 2.the cell free coelomic fluid by yeast cell adsorption + no regulating yeast cells； 3.the cell free coelomic fluid+no regulating yeast cells； 4.the PBS isotonic buffer + regulating yeast cells.

2.2 SDS-PAGE分析

将3种提取出的样品进行电泳，受调理酵母细胞提取出的含调理素样分子成分的样品在200.00 ku下方显示为1个明显条带(图2a)。非调理酵母细胞提取出的不含调理素样分子成分的样品，其对应位置并没有显示出条带(图2b)，含调理素样分子的光棘球海胆无细胞体腔液成分，在200.00 ku下方同样显示出一个明显的条带，由于光棘球海胆无细胞体腔液内除了调理素样分子之外还有其他的蛋白质，因此有多个条带(图2c)。由此可见，光棘球海胆体腔液应该存在某种调理素样分子，能够被酵母细胞吸附(图2)。通过测定电泳图相对迁移率，得出分子质量约为149 ku(图3)。

图2 光棘球海胆体腔液调理素样分子的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of opsonin-like molecule in coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白质marker；a.受调理酵母细胞提取的成分； b.非调理酵母细胞提取的成分； c.光棘球海胆无细胞体腔液. M.protein marker;a.the composition seperated from regulating yeast cells; b.the composition seperated from no regulating yeast cells; c.no cell coelomic fluid of sea urchin S. nudus.

图3 Marker的分子质量标准曲线Fig.3 Molecular weight standard curve of marker

2.3 调理素样分子纯化结果

光棘球海胆无细胞体腔液经透析和SephadexG-200凝胶过滤层析，收集流下来的50管液体中紫外分光检测出现1个峰值(图4)，其峰值样品的电泳显示，200.00 ku下方呈现为1个明显条带(图5)。测定电泳图相对迁移率，得出分子质量约为156 ku(图6)。

图5 纯化的调理素样分子的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified opsonin-like molecule in celll-free coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白质marker；a.30 μL纯化调理素样分子； b.40 μL纯化调理素样分子； c.50 μL纯化调理素样分子. M.protein marker;a.30 μL purified opsonin-like molecule; b.40 μL purified opsonin-like molecule; c.50 μL purified opsonin-like molecule.

图6 Marker的分子质量标准曲线Fig.6 Molecular weight standard curve of marker

2.4 调理素样分子的功能测定分析

将光棘球海胆无细胞体腔液经过提取分离后得到调理素样分子，等渗缓冲溶液中，测定其在不同添加量不同时间点，对光棘球海胆吞噬细胞的吞噬活性的影响程度。试验结果表明，添加0.5、1.0、1.5 mL经纯化调理素样分子的试验组的吞噬率均高于对照组(图7)。反应开始15、30、45、60 min 4个时间点分别测定3种不同添加量的调理素样分子对光棘球海胆吞噬细胞的吞噬活性的影响结果(图8)。提取的光棘球海胆体腔液调理素样分子能够明显提高光棘球海胆吞噬细胞的吞噬能力，反应60 min时，0.5、1.0 mL和1.5 mL组与对照组均有极显著差异(P<0.01)，调理素样分子含量越高，越能促进光棘球海胆吞噬细胞的吞噬活性。

图7 不同添加量调理素样分子溶液中吞噬细胞的吞噬率Fig.7 The rate of phagocytosis of opsonin-like molecule in different addition amount

图8 各时间点含调理素样分子的溶液中吞噬细胞的吞噬率Fig.8 The rate of phagocytosis in opsonin-like molecule fluid at different time

3 讨 论

3.1 光棘球海胆调理素样分子的免疫机制

棘皮动物没有专门的循环器官，通过体腔膜细胞的纤毛摆动在体腔液中进行营养物质的运输，体腔液中的体腔细胞具有吞噬作用。调理素样分子是能够促进吞噬细胞作用的一种蛋白质，是一条连接吞噬细胞和异物的“桥梁”[18]，在棘皮动物免疫系统中是重要的一部分。通过对光棘球海胆的体腔吞噬细胞在不同基质里吞噬率的不同，证明了光棘球海胆体腔液中存在刺激吞噬细胞作用的调理素样分子，能够标记酵母细胞，增强吞噬细胞活性，从而调节免疫的进程。

本试验中，提取的光棘球海胆体腔液调理素样分子的分子质量约为156 ku，与张颖等[12]在虾夷马粪海胆体腔液中提取出的调理素样分子分子质量(250.62 ku)不同。在等渗缓冲液、经酵母细胞吸附过无细胞体腔液以及光棘球海胆无细胞体腔液这3种不同反应基质，本试验结果与已有研究结果一致，光棘球海胆的无细胞体腔液基质吞噬率最高，可知其中存在某种调理素样分子和未知物质，共同促进吞噬细胞的吞噬作用。在等渗缓冲溶液光棘球海胆吞噬细胞对非调理和受调理酵母细胞的吞噬能力有差异，是由于在受调理酵母细胞表面吸附了某种调理素样分子，能起到增强吞噬细胞活性的作用。

3.2 调理素样分子的纯化

调理素在外来物质入侵生物时对其进行标记，帮助生物机体的吞噬细胞能够精准识别并清除外来物质。国内外研究表明，已在多种海参、海胆[11-12]的体腔液中发现调理素的存在，并通过透析和层析提取出调理素样分子进行了功能测定。笔者将这方面研究较少的光棘球海胆作为试验对象，从受调理酵母细胞和非调理酵母细胞以及光棘球海胆无细胞体腔液这3种不同成分提取的样品进行SDS-PAGE分析，其结果再次确定了光棘球海胆体腔液中有调理素样分子的存在，调理素样分子能够吸附于酵母细胞的表面，含调理素样分子成分的样品进行电泳时均在200.00 ku下方显示有1个明显条带。

对光棘球海胆体腔液调理素样分子进行提取纯化的试验过程，参考了刺参凝集素[19]和虾夷马粪海胆体腔液调理素[12]的提取工艺。将光棘球海胆无细胞体腔液用透析膜在4 ℃冰箱透析60 h，之后通过平衡过的葡聚糖G-200柱进行层析，小管收集流下来的液体，用紫外分光光度计在280 nm下进行检测，结果发现，液体对光的吸收度出现1个峰值，峰值处即为纯化的调理素样分子，进行电泳分析后得出其分子质量约为156 ku，说明光棘球海胆体腔液内调理素样分子的分子质量约为156 ku。

3.3 光棘球海胆调理素样分子的功能性质

调理素是生物体内一类促进吞噬作用的蛋白质，能够帮助清除体内的病原体，参与炎症反应[20]，维持体腔液环境稳态[21]。目前对调理素的相关试验不断进行，已经在多种水产养殖动物中发现了促进吞噬作用的物质存在[7-10]。笔者通过测定光棘球海胆吞噬细胞在不同介质里对不同处理的酵母细胞的吞噬率，确定了光棘球海胆体腔液中有增强吞噬细胞活性的物质存在，经过透析和层析将调理素样分子提取纯化出来，计算得出其分子质量约为156 ku。

将纯化的光棘球海胆调理素样分子进行功能测定，在反应开始15、30、45、60 min 4个时间点测定分别添加0.5、1.0、1.5 mL的调理素样分子对光棘球海胆吞噬细胞的吞噬活性的影响程度。等渗缓冲溶液中，在一定添加量范围内，4个时间点调理素样分子添加量越高，光棘球海胆吞噬细胞的吞噬率越大。说明光棘球海胆体腔液的调理素样分子能增强吞噬细胞的吞噬活性，帮助吞噬细胞对体腔液外来物质进行清除，并且调理素样分子的添加量能够影响吞噬进程，一定范围内，当添加量增加时，能够刺激更多的体腔吞噬细胞参与免疫反应。