梨小食心虫细胞色素P450 CYP6AE123 基因的克隆及表达分析

韩 慧，王彪龙，李 恩，胡 军，马瑞燕，高玲玲，郭艳琼

（1.山西农业大学植物保护学院，山西太谷030801；2.澳大利亚联邦科学与工业研究组织农业与食品部，文布利西澳6913）

梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）属鳞翅目卷蛾科小食心虫属，在全世界广泛分布，主要为害桃、梨等经济作物，导致果品产量和质量严重下降[1-6]。目前，常用的防治手段为化学防治，但长时间的不合理用药导致梨小食心虫对某些杀虫剂敏感度降低[7]。已有不少研究表明，细胞色素P450 在昆虫对杀虫剂的代谢中起着非常重要的作用。

细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一类能够代谢昆虫内源化合物（如激素等）和外源性化合物（如植物次生物质、杀虫剂等）的酶系，在昆虫的解毒、细胞代谢和平衡中起着关键作用[8]。CYP 酶的诱导或抑制是昆虫与药物相互作用的基础，它可以使昆虫产生拒食、趋避、中毒等症状。细胞色素P450 具有多个进化支，包括CYP2、CYP3、CYP4 以及线粒体CYP 簇[9]，其中CYP3 簇最大，包含CYP6、CYP9 家族在内的多个家族。CYP6 家族属于昆虫特有的家族，不少研究证明，该家族基因参与外源物质的代谢。例如飞蝗CYP6 家族参与了外源杀虫剂的代谢[10]，其中CYP6HC1与CYP6HCL1在氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂代谢中起关键性作用[8]；冈比亚按蚊CYP6M2基因可对多种不同类别的杀虫剂产生耐药性[11]。此外，目前常用的杀虫剂有阿维菌素、吡虫啉以及高效氯氟氰菊酯等。其中，阿维菌素因其杀虫效果好、对人畜毒性低等优势被广泛应用于梨小食心虫的防治[12]。

本研究从前期构建的转录组数据库进行BLAST 检索，获得一个细胞色素P450 基因序列。通过克隆获得cDNA 全长序列，提交P450 国际命名委员会命名为CYP6AE123，并对其进行生物信息学分析和基因表达模式分析，以明确其不同发育阶段和不同组织部位的表达特性，及其对不同浓度阿维菌素的响应，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用梨小食心虫采自山西省晋中市太谷区西山底桃园，饲养于山西农业大学生物安全与生物防治研究基地人工培养箱中（MGC-450HP），经室内人工饲养50 代以上，光周期15 L∶9 D，相对湿度70%～80%；幼虫饲喂人工饲料，成虫饲喂10%蜂蜜水[13]，期间未接触任何杀虫剂。

收集梨小食心虫不同发育阶段样品，成虫3 头、蛹5 头、五龄幼虫5 头、四龄幼虫5 头、三龄幼虫10 头、二龄幼虫30 头、一龄幼虫50 头以及卵100 粒[14]。不同组织选取羽化30 h 之内的健康梨小食心虫成虫，分别取头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢、卵巢[15]，每个重复取60 头成虫。采用阿维菌素LC1（019.82 μg/mL）、LC3（072.90 μg/mL）、LC5（0179.66 μg/mL）分别处理健康的梨小食心虫成虫，24 h 后收集存活的成虫样品。以上材料均放置于液氮中速冻，存于-80 ℃冰箱中备用，以上样品均设置3 次生物学重复。

1.2 梨小食心虫CYP6AE123 克隆

以云杉卷叶蛾CYP6AE83基因为参考序列，对梨小食心虫转录组数据检索、BLAST 比对，获得P450 基因的全长cDNA 序列。利用Primer Preimer 5.0 设计特异性引物（表1）。

根据RNAisoTMPlus 试剂盒说明书提取成虫总RNA，并取1 μg 反转录成cDNA，作为PCR 扩增的模板。PCR 反应体系（50 μL）：5×TransStartRFast Pfu Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、cDNA（1×）2 μL、TransStartRFast Pfu DNA polymerase 1 μL、ddH2O 31 μL。反应程序：95 ℃2 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃1 min，40 个循环；72 ℃5 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于紫外光下切下目的条带回收纯化。将目的基因连接至pEASY-Blunt 载体中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。将其涂布于LB 固体培养基中，挑取单克隆验证，并进行LB 液体培养基过夜培养。菌液验证后送上海生工生物有限公司测序，提交P450 命名委员会进行命名。

表1 引物

1.3 梨小食心虫CYP6AE123 生物信息学分析

P450基因的开放阅读框（openreadingframe，ORF）及氨基酸序列使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）预测；采用ExPASy 的在线工具Prot-Param （http://web.expasy.org/protparam/）预测CYP6AE123 蛋白的理化性质；采用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.-dk/services/SignalP/）分析信号肽；用NPS@_HNNsecondary[15]（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_consensus.pl）预测蛋白质的二级结构；采用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）进行蛋白质的三级结构同源建模。

根据NCBI BLASTX（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的比对结果找出同源性较高的其他物种的氨基酸序列，在DNAMAN 进行序列比对；采用MEGA 7.0 软件并运用邻接法（Neighbor Joining，NJ）构建进化树，抽样次数（Bootstrap）设置1 000 次。

1.4 梨小食心虫CYP6AE123 表达水平分析

提取不同发育阶段、不同组织及不同浓度阿维菌素处理后的梨小食心虫总RNA，并取1 μg 为模板反转录为cDNA。以β-actin为内参基因，RT-qPCR检测CYP6AE123基因的相对表达量。每组样品均设置3 次技术重复。反应体系（20 μL）：SYBR qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L 的上下游引物（表1）各0.4 μL、稀释10 倍的cDNA 模板1 μL、去离子水8.2 μL。扩增条件为：94 ℃30 s；94 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃，30 s，于72 ℃收集荧光，共40 个循环。采用2-ΔΔCT 法[16]计算相对表达量。

1.5 数据分析

使用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析（one way-ANOVA），采用Tukey 法进行差异显著性分析，采用Excel 2016 进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 梨小食心虫CYP6AE123 的克隆及序列分析

通过检索、比对、克隆和测序，获得梨小食心虫细胞色素P450CYP6AE123的cDNA 全长序列（图1），提交P450 命名委员会，命名为CYP6AE123。ORF 长度为1 524 bp，编码507 个氨基酸；蛋白分子质量为58 176.72 u，理论等电点为7.07，不稳定指数为37.50，故该基因编码的蛋白是稳定的；脂肪系数为89.41，总平均亲水性为-0.110，属疏水性蛋白。二级结构表明，CYP6AE123编码的蛋白主要由α 螺旋（46.55 %），无规则卷曲（42.80%）以及延伸链（8.48 %）组成，三级结构同源建模模拟了P450CYP6AE123的特征序列和空间结构（图2）。

2.2 梨小食心虫CYP6AE123 基因的系统发育分析

BLAST 比对结果表明，梨小食心虫与鳞翅目昆虫苹果蠹蛾Cydia pomonella（Cp）、小线角木蠹蛾Streltzoviella insularis（Si）、棉铃虫Helicoverpa armigera（Ha） 的氨基酸序列一致性分别高达83.67%、57.39%、52.61%（表2）。

表2 梨小食心虫CYP6AE123 的BLAST 比对

多序列比对如图3 所示，梨小食心虫CYP6AE123具有细胞色素P450 的特征区域，包括螺旋I、螺旋C、螺旋K、Meander 区以及血红素结合区。

系统发育分析结果显示（图4），进化树中多为各物种的CYP6AE 家族，表明克隆得到的基因属于CYP6AE 亚家族；且梨小食心虫CYP6AE123与烟草天蛾CYP6AE129聚在一起，表明二者亲缘关系最近，可能具有相似功能。

不同发育阶段表达模式如图5 所示，CYP6AE123在梨小食心虫所有发育阶段均有表达，成虫期和五龄幼虫相对较高，且差异达显著水平（P＜0.05）；其他龄期表达相对较低，且各阶段之间无明显差异。其中，卵期表达量最低，成虫期表达量是卵期的49.20 倍，五龄幼虫时期表达量是卵期的26.92 倍。

不同组织表达结果表明，CYP6AE123在成虫的脂肪体中表达量最高，中肠次之；前肠和精巢中表达量最低；脂肪体中CYP6AE123表达量为精巢中的8.81 倍、前肠的6.35 倍；中肠表达量是精巢的5.42 倍、前肠的3.90 倍（图6）。

采用不同浓度的阿维菌素对梨小食心虫成虫进行处理，结果表明，低浓度阿维菌素（LC10、LC30）处理后，CYP6AE123表达量较CK 降低，但二者间无显著变化；当浓度增加到LC50（179.66 μg/mL）时，CYP6AE123表达显著增加，为CK 的5.80 倍，且二者间差异达显著水平（P＜0.05）（图7）。

3 结论与讨论

本研究对梨小食心虫CYP6AE123的多序列比对结果表明，该基因的氨基酸序列与苹果蠹蛾、小线角木蠹蛾、棉铃虫的氨基酸序列一致性分别高达83.67%、57.39%、52.61%，且均有细胞色素P450 的保守区域，这些保守区域常被用作鉴定P450 的主要特征[17]。

本研究为了进一步研究CYP6AE123的分子特性和生物功能，对不同发育阶段与不同组织中CYP6AE123的表达水平进行了表达模式研究，结果显示，梨小食心虫CYP6AE123在成虫期和五龄幼虫期表达量较高，因为成虫期是梨小食心虫为数不多暴露于环境中的时期，也是农民防治的关键期[18]，在这个发育阶段CYP6AE123基因表达量上调，相似的结果在斜纹夜蛾中也有体现[19]。不同组织中基因表达量显示，CYP6AE123基因在脂肪体中表达量最高，中肠次之，可能是因为脂肪体主要用于储存能量以及对外源有毒物质的代谢[20]，而中肠是昆虫的消化器官，暗示该基因可能与梨小食心虫外源物质代谢有关。研究发现，杀虫剂对昆虫的诱导表达与基因代谢外源物质密切相关。例如，在氯虫苯甲酰胺处理甜菜夜蛾后，CYP9 家族基因被诱导，进一步验证Unigene0035508 基因参与代谢氯虫苯甲酰胺[21]；苹果黄蚜细胞色素P450 基因AcCYP6CY14表达可增强吡虫啉抗性[22]。本研究发现，高浓度阿维菌素（179.66 μg/mL）诱导梨小食心虫CYP6AE123表达，但该基因是否参与梨小食心虫对阿维菌素的代谢尚不明确，下一步将对其进行RNAi，进一步明确其功能。

本研究克隆了梨小食心虫CYP6 家族基因CYP6AE123，该基因属于CYP6AE 亚家族，且包含细胞色素P450 的识别特征；表达分析研究表明，CYP6AE123在成虫期和脂肪体高表达，且被高浓度的阿维菌素诱导表达，推测其可能参与梨小食心虫对阿维菌素的代谢，研究结果可为进一步探究梨小食心虫CYP6AE123基因的功能奠定基础。