陆地棉脂氧合酶家族基因的生物信息学及表达分析

韩立军，刘萌萌，刘宝玲，王志龙，薛金爱，李润植

（山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西太谷030801）

脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）广泛存在于动植物及真菌中，属氧化还原酶，是一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，专一催化具有顺，顺-1，4 戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应[1]。在植物中，LOX 的作用底物主要是亚油酸和亚麻酸[2]，其中，9-LOX 和13-LOX 分别能够催化底物生成9S- 氢过氧化十八碳二烯酸（9-HPOD）和13S- 氢过氧化十八碳二烯酸（13-HPOD），之后又经过一系列代谢途径和酶促反应，最终生成氧脂素（Oxylipins）[3]，氧脂素可增强植物抗逆性[4]。研究发现，LOX具有促进种子萌发过程中储藏脂质（TAG）的降解、调控植物营养器官的生长发育、增强植物抵抗生物与非生物胁迫以及产生植物特有香气等功能[5]。LOX 是茉莉酸（JA）合成途径中的第1 个关键酶[6-7]，进而诱导抗逆基因表达以抵御环境胁迫。研究还发现，LOX 基因在植物的根、茎、叶、花、果实、种子等组织中均有差异表达[8]；番茄中14 个LOX 在热、冷、干旱、盐4 种非生物胁迫下呈现出不同的表达量[9]，其中，冷胁迫是影响农作物产量和品质的重要因素之一。

棉花是我国重要的纤维作物和油料作物，在我国经济发展中具有不可或缺的作用[10]。研究表明，棉花起源于亚热带，适合生长在温暖的气候环境中，而在我国北方棉区，气候寒凉，在棉花生长早期可能会遇到倒春寒等低温天气，不仅会使植物细胞膜流动性减弱，细胞通透性增大，导致内容物流失，严重影响棉花发育，而且会造成植物死亡[11-13]；同时棉花幼苗易受真菌感染，最终影响棉花产量和棉纤维品质。因此，探究棉花应对冷胁迫的响应机制对我国棉花生产与安全具有重要意义。

陆地棉（Gossypium hirsutumL.）是异源四倍体（4n＝52），由A 基因组和D 基因组组成[14-15]。本研究基于已经公布的棉花基因组数据，对GhLOX家族基因进行鉴定，对其基因结构、氨基酸理化性质、进化关系进行生物信息学分析，并对GhLOX家族基因在不同组织和不同非生物胁迫下的差异表达模式进行分析后，进一步对部分GhLOX基因在4 ℃冷胁迫下的表达模式进行RT-qPCR 验证，旨在筛选GhLOX差异基因，为今后GhLOX的功能研究奠定基础，并为我国棉花安全生产提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 陆地棉GhLOX 基因家族成员的鉴定、染色体定位和理化性质分析

在拟南芥数据库TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中获得6 个AtLOX 蛋白序列，在陆地棉数据库CottonFGD（https://cottonfgd.org/）和Phytozomez 数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/）中进行BLASTP比对，获得陆地棉GhLOX 同源蛋白质序列，删除重复序列，用pfam（http://pfam.xfam.org/）和CDD 进一步删除不含有PLAT（PF01477）和Lipoxygenase（PF00305）结构域的序列，最终获得陆地棉GhLOX家族成员。利用TBtools 进行染色体定位及命名。

利用在线软件SIB（http://expasy.org/）预测氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、不稳定系数和亲水性指数。使用LocTree3（https://rostlab.org/services/loctree3/）预测亚细胞定位。利用在线网站NPSA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home） 进行GhLOX 蛋白质二级结构预测。

1.2 陆地棉GhLOX 基因结构及保守基序分析

利用在线网站GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）预测陆地棉LOX 基因结构；利用在线网站MEME（http://meme-suite.org/）预测陆地棉LOX 基因保守基序，参数设定为默认值，保守基序数目为12。

1.3 陆地棉GhLOX 家族基因系统进化分析

在NCBI 中获得水稻、萝卜、拟南芥LOX 蛋白序列（表1）。

表1 萝卜、拟南芥、水稻LOX 基因登录号

在MAGE 7.0 软件里采用邻接方法（Neighborjoining，NJ）对拟南芥、水稻、胡萝卜和陆地棉LOX蛋白构建系统进化树，抽样次数（Bootstrap）设置为1 000 次。

1.4 陆地棉GhLOX 家族基因的组织特异性及4 种非生物胁迫下的表达模式分析

在棉花数据库CottonFGD 中下载陆地棉LOX基因家族在不同组织及冷、热、盐、PEG 这4 种胁迫下的转录组数据，利用软件TBtools 绘制GhLOX家族基因差异表达热图。

1.5 陆地棉部分基因在4 ℃冷胁迫下的表达分析

根据陆地棉GhLOX冷胁迫的热图结果，每个亚家族各选取2 个基因，分别为9-LOX 亚家族的GhLOX-D9.2、GhLOX-D13；13-LOX Ⅰ亚 家 族 的GhLOX-A8.1、GhLOX-D8.1；13-LOXⅡ亚家族的GhLOX-D5、GhLOX-D10，用Primer 6.0 设计特异性引物（上海生工公司合成引物，表2）。

表2 GhLOX 实时荧光定量PCR 分析所用引物

取长势良好且大小一致的陆地棉冀丰1271 的幼苗于4 ℃低温培养0、1、3、6、12、24、48 h，提取叶片RNA，反转录为cDNA。以hisone为内参基因，利用RT-qPCR 进行差异表达分析。总反应体系为10 μL，其中，TB Green 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O3.4 μL。反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃5 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，40 个循环。每个样品设置3 次重复，用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 陆地棉GhLOX 家族基因成员的鉴定、染色体定位和蛋白理化性质分析

通过检索比对，最终鉴定出22 个GhLOX，根据染色体位置和顺序进行命名，结果如图1 所示。

由图1 可知，22 个GhLOX不均匀地分布在15 条染色上，其中，在A 亚组的8 条染色体上（A2、A3、A5、A6、A8、A9、A10、A13）分布着11 个GhLOX基因，在D 亚组的7 条染色体上（D2、D5、D6、D8、D9、D10、D13）分布着11 个GhLOX基因；在A2、A6、A8、D2、D6、D8、D9 这7 条染色体上各有2 个GhLOX基因，其余8 条染色体上均只有1 个GhLOX基因。

对22 个GhLOX家族基因蛋白的理化性质分析表明，编码氨基酸数目为775～919 个；分子质量范围为87.6～104.15ku；除GhLOX-A3、GhLOX-D2.2、GhLOX-A10、GhLOX-D10 呈碱性外，其余18 个GhLOX 均呈酸性；11 个GhLOX 的不稳定系数小于40，结构稳定性，其余11 个LOX 蛋白不稳定系数大于40，表现出不稳定性；亲水指数均为负值，即均为亲水性蛋白；GhLOX-A8.1、GhLOX-A8.2、GhLOXA13、GhLOX-D8.1、GhLOX-D8.2、GhLOX-D13 这6 个LOX 蛋白定位在细胞质中，其余16 个均定位在叶绿体中（表3）。

表3 GhLOX 蛋白理化性质分析

2.2 陆地棉GhLOX 家族基因系统进化分析

利用拟南芥、水稻、萝卜、陆地棉LOX 蛋白构建进化树如图2 所示，根据催化底物时的不同反应位置，将GhLOX 蛋白分为9-GhLOX 和13-GhLOX 共2 类，13-GhLOX 亚家族又分为TypeⅠ和TypeⅡ共2 类，其中，TypeⅠ类LOX蛋白序列相似性高达75%，缺乏叶绿体转运肽，TypeⅡ类LOX 蛋白间序列相似性为35%左右，含有叶绿体转运肽[8]。在GhLOX基因家族中，13-GhLOXⅠ亚家族最大，有9 个基因；13-GhLOXⅡ亚家族最小，有6 个基因；9-GhLOX家族有7 个基因。从进化树中可以看出，陆地棉与萝卜亲缘关系更近。

2.3 陆地棉GhLOX 基因结构及保守基序的分析

通过对GhLOX编码的氨基酸序列进行比对发现，大部分氨基酸位点是保守的；由38 个氨基酸残基组成的结构域中包含5 个组氨酸（His，H）残基，其通过形成片段“H-X4-H-X5-H-X17-H-X8-H”来结合铁原子（图3），在LOX 酶发挥功能时具有重要作用[16-17]。

GhLOX基因家族外显子数目为7～10 个，其中，9-GhLOX的基因结构相似，外显子数目为8～10 个；13-GhLOX亚家族的基因结构相差较大，且13-GhLOXⅡ相比于13-GhLOXⅠ基因结构相差较大。其中，13 个GhLOX基因同时拥有5′-UTR 和3′-UTR，4 个GhLOX基因只有3′-UTR，1 个GhLOX基因只有5′-UTR，4 个GhLOX基因没有非翻译区。此外，13-LOX 中有3 个基因都含有最长内含子，3 个LOX 亚家族表现出了相似的基序排序，除GhLOX -A2.2、GhLOX -A3、GhLOX -A5、GhLOX -D2.2、GhLOX-D5不含有Motif11 外，其余基因均含有Motif1～Motif12，值得注意的是，GhLOX-D5基因含有2 个Motif10（图4）。

2.4 GhLOX 蛋白的二级结构分析

通过对陆地棉二级结构预测发现，α- 螺旋所占比例为32.16%～40.81%，延伸链占14.52%～20.92%，β- 折叠占7.13%～10.42%，无规则卷曲占31.57%～41.59%；其二级结构以α- 螺旋和无规则卷曲为主（表4）。

表4 GhLOX 蛋白的二级结构分析 %

2.5 GhLOX 家族基因在不同组织及在冷、热、盐、PEG胁迫下的表达模式分析

由图5 可知，9-GhLOX亚家族的7个成员中，GhLOX-A9、GhLOX-D9.2、GhLOX-A13、GhLOXD13在各组织均有表达；13-GhLOX I亚家族的9 个成员在各组织中多为不表达或低表达；而13-GhLOXII亚家族的6 个基因在各组织中均有表达，特别是GhLOX-A5、GhLOX-D5在花托中高表达，可能预示着这2 个基因是花托发育中的关键基因。综上可知，具有组织特异性基因多为9-GhLOX和13-GhLOX II亚家族成员。

9-GhLOX亚家族中的GhLOX-A9、GhLOXD9.2、GhLOX-A13、GhLOX-D13在4 种胁迫下均有表达。而13-GhLOX I中9 个基因均表现出低表达或不表达；13-GhLOX II亚家族的6 个基因在4 种胁迫中均表达，值得注意的是，GhLOX-A5和GhLOX-D5表现出了极高的表达量。由此推测13-GhLOX II亚家族在应对非生物胁迫时起到关键作用，保证了植物体的正常生命活动。

2.6 GhLOX 基因在4 ℃冷胁迫下的表达模式分析

冷胁迫下的差异表达分析结果显示（图6），9-GhLOX家族基因中的GhLOX-D9.2和GhLOXD13在0～12 h 的表达受到抑制，之后表达恢复；13-GhLOXⅠ家族基因中的GhLOX-A8.1和GhLOX-D8.1均高于0 h 的表达量，其中，GhLOXA8.1在12 h 表达量最高，而GhLOX-D8.1在1 h 的表达量最高，且彼此之间的差异显著（P＜0.05）；13-GhLOXII家族基因中的GhLOX-D5和GhLOXD10的表达量均显著高于0 h（P＜0.05），整体呈现先升高后降低的趋势，其中，GhLOX-D5在6 h 表达量最高，约为0 h 的15.5 倍，GhLOX-D10在24 h表达量最高，比0 h 上调约8 倍。

3 结论与讨论

本研究鉴定的22 个GhLOX家族基因，在陆地棉的A 亚组和D 亚组上各分布11 个GhLOX基因，在细胞质与叶绿体中行使其功能；均含有5 个组氨酸残基相连的保守基序，二级结构以α- 螺旋和无规则卷曲为主。依催化底物生成的中间产物不同，被分为9-GhLOX、13-GhLOX I、13-GhLOX II共3 个亚家族，其中，13-GhLOX II亚家族的基因结构差异最大。值得注意的是，13-GhLOX I家族GhLOX-A13、GhLOX-D13在进化树中与AtLOX1聚类结果表明，这2 个基因也可能在根发育、叶衰老、病原菌感染和茉莉酸甲酯含量高时被激活[18]。13-GhLOX II家族的GhLOX-A5、GhLOX-D5在进化树中与AtLOX2的聚类结果表明，这2 个基因可能通过合成茉莉酸来引起相关抗逆反应，以保证植物的正常生长[19]。

本研究差异表达模式发现，GhLOX存在组织表达特异性和非生物胁迫响应基因，尤其是13-GhLOX II家族基因中的GhLOX-D5和GhLOXD10在花托中超高表达，且积极参与非生物胁迫的应答，这与拟南芥中的AtLOX能够对不良环境等非生物胁迫下做出应激反应相一致[20]。进一步对低温处理不同时间的GhLOX家族基因的表达模式研究发现，9-GhLOX亚家族的GhLOX-D9.2、GhLOX-D13在受到短时间（＜12 h）冷胁迫时表达量下降，胁迫时间高于12 h 的表达量可恢复到0 h 水平，推测这2 个基因存在一个逐步适应的过程；13-GhLOX I亚家族在胁迫开始后表达量上升，之后开始下降，反应较为迅速；13-GhLOX II亚家族在抵抗冷胁迫时反应更为迅速，且表达量更高。尽管本研究表明，6 个GhLOX基因都在冷胁迫中呈现应激反应，但应答的速度、表达量上调的幅度和持续的时间都存在差异，这还有待进一步研究。

本研究共鉴定了22 个GhLOX家族基因，A 基因组和D 基因组各分布着11 个基因，多为酸性亲水性蛋白，定位于叶绿体和细胞质中，均含有“H-X4-H-X5-H- X17-H-X8-H”38 个残基的保守序列。进化关系显示，与萝卜的亲缘关系更近。差异表达分析显示，GhLOX-A5和GhLOX-D5在花托中具有组织表达特异性，且在4 种胁迫下均表现为超高表达，特别是GhLOX-D5在4 ℃低温处理6 h 的表达量最高，约为0 h 表达量的15.5 倍，说明GhLOX-D5高度参与陆地棉冷胁迫的响应，为棉花在逆境下的育种提供了一定的理论基础。而GhLOX基因家族的功能和在胁迫下的响应机制还有待进一步研究。