基因变异筛查技术在原发性高血压诱发脑梗死患者诊疗中的应用

宁学斌 刘晓光 张岸平 高利常 李 冀

华北理工大学理学院 河北唐山 063210; ①生命科学学院

原发性高血压(EH )是一种常见的危害人类健康的心脑血管疾病，是冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)、脑梗死和肾功能衰竭的主要危险因素之一[1]。EH及其诱发的脑梗死作为心血管疾病主要危险因素存在一定的发病聚集性，二者并存可使心血管疾病发病风险进一步增加，但目前对二者的并发机制尚不清楚,亟待探讨EH诱发脑梗死的分子遗传机制，以有效降低心血管疾病发病率。目前研究普遍认为EH、CHD 等心血管疾病为多因素疾病，因多个易感基因的多个单核苷酸多态性(SNPs)微效作用的累加及环境因素共同作用而发病。Jeunemaitre[2]等研究提出，血管紧张素原 (AGT)基因M235T位点多态性与EH之间有显著关联。本次研究以SNPstream技术[3]和RFLP-PCR技术筛查AGT及相关基因变异，并分析可能的基因-基因、基因-环境之间的交互作用，为深入探讨和阐明ET诱发脑梗死的分子遗传机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 2014年3～10月收集唐山市3所“三甲”医院的初发脑血栓患者498例为观察组，入选标准：符合WHO/ISH(国际高血压联盟)的高血压诊断标准；未服用降压药物者收缩压/舒张压≥140/90mmHg，服用降压药物者收缩压/舒张压<140/90mmHg。排除标准：患有器质性疾病、精神性疾病、内分泌系统疾病、恶性肿瘤的患者。根据匹配因素(民族、性别、年龄)选择同期健康体检者506人为对照组，入选对象对研究均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1数据调查及临床检测 调查内容包括姓名、性别、年龄、身高、体质量、吸烟史、饮酒史等。采用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)等。

1.2.2建立DNA标本库 由专人采集被检者晨起空腹静脉血3mL，加入EDTA抗凝管，用酚-氯仿法提取血液基因组DNA，实施浓度测定及标化，检测DNA浓度后，用高纯水稀释至20ng/μL，在-20℃样品库中保存。

1.2.3nmSNP位点的筛选 在人类单倍体图计划数据库上，对中国汉族人的遗传信息进行检索，获取AGT基因上的12个tagSNP信息，其中AGT基因标签SNP共8个高突变位点。再利用NCBI网站检索确定处于同一连锁群的AGT基因的SNPs突变位点，选取标准为(SNP,AGT,1,M issensehom o sapiens)总计51个位点，剔除第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ外显子及合并相同报道后，有21个位点是发生在AGT基因第Ⅱ外显子上的错义突变SNP位点，它们分别是rs61762541等。从21个位点中选取文献报道中高频错义突变位点，包括rs699(M235T)、rs7079、rs1078499、rs11122577、rs11122575、rs2478523、rs2493132、rs2478543、rs3789678、rs3789671、rs3889728、rs7539020。将AGT基因长度前后扩大5kb，增加4个位点，分别为 rs11568046、rs2493137、rs4628514、rs7536290。总计16个SNP位点作为研究的目标。

1.2.4SNPs分型 将-20℃保存的DNA稀释到10ng/μL。将多重PCR(M ultiplex PCR)技术与单碱基延伸分型技术结合起来进行PCR扩增 ，扩增后产物进行纯化、杂交。采用Beckman公司SNP分型系统(SNP Stream)对获得含有待检测突变位点的基因片断进行12重或者48重的多重LDR(M ultiplex LDR)反应，最后通过微阵列将其区分开，并采用测序仪/基因分析仪毛细管电泳检测分析结果[4-6]。

1.2.5多重引物、tag SNP的PCR引物及单碱基延伸引物设计 首先要选定tagSNP，将其rs编号输入至AP Editor程序，在NCBI db SNP下载位点附近序列和mask序列，使其转换为基因型(如G/T型转换为C/A型)，然后通过引物设计网站查找相关的引物信息。引物设计成功的SNP位点，将获得三条引物，包括PCR引物2条和单碱基延伸引物1条。

1.2.6聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测 用于rs7536290位点，检测基因多态性。查询NCBI数据库，获得位点序列，使用Primer premier 5.0软件设计PCR引物。PCR反应；PCR 扩增产物电泳；限制性内切酶Alu I内切反应。电泳检测：Alu I 的识别序列为 AGCT。利用错配引物，将错配碱基引入，以获得酶切识别序列。当位点碱基是GG时，内切酶会将PCR产物分成126bp和161bp片段；当位点碱基是AA时，内切酶无法识别位点，PCR产物的长度不变；当基因型是杂合子时，酶切电泳可将287bp、161b、126bp 三个条带。

1.3统计学方法 运用SPSS 13.0软件行统计分析。①单位点关联分析：两组之间单位点的基因频率和等位基因频率分布差异通过卡方检验，调整混杂因素非条件Logistic回归分析；②各位点之间的LD度量：各位点两两之间的D值和P值用Haploview软件进行计算；③单倍型关联性分析：应用Haploview软件推定各样本的单倍型，再用卡方检验分析各单倍型频率在两组之间的差异；④计数资料采用方差分析，分类资料采用卡方检验结合Logistic回归模型评价。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组临床资料比较 两组年龄、性别、HDL-C比较，差异无统计学意义(P>0.05)。观察组身高低于对照组，体质量、BMI、TG、TC高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料和生化指标比较

2.2两组tag SNP的基因型频数与HWE检验比较 在16个tagSNP中，15个位点符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)，提示，SNPStream、PCR-RFLP技术方案可行、结果可信，入选对象具有代表性。位点缺失占比为2.71%(444/16384)，见表2。

2.3tag SNP的危险性分析 rs699多态性、rs7079多态性、rs1078499多态性、rs2478523多态性、rs2478543多态性、rs2493137多态性、rs3789671多态性、rs3889728多态性、rs4628514多态性、rs7536290多态性、rs7539020多态性、rs11122575多态性、rs11122577多态性、rs11568046多态性与EH诱发脑梗死病无相关性(P>0.05)。rs2493132多态性、rs3789678多态性分别与EH诱发脑梗死病相关(P<0.05)。携带 rs3789678C等位基因发生疾病风险比携带 T 等位基因增加1.28倍(95%CI： 1.08-1.52，P=0.004)。携带rs2493132C等位基因发生疾病风险比携带T等位基因增加1.19倍(95%CI：1.04-1.35，P=0.014)。见表3。

表2 两组tag SNP的基因型频数与HWE检验比较

SNP位点nrs3789678rs3889728rs4628514rs7536290rs7539020rs11122575rs11122577rs11568046等位基因C/TA/GC/TA/GC/TC/TA/CC/T观察组498AA3481211113104256116AB96254259163210232145115BB2511712521235198337366FL296341112511对照组506AA3471091033174757155AB131240276165209235145114BB2615112623249213340383FL26111164H-W检验χ2值12.31.670.580.280.0050.150.252.56P值0.00030.180.460.610.980.710.660.13

表3 tag SNP的危险性分析

SNP位点nrs3789678rs3889728rs4628514rs7536290rs7539020rs11122575rs11122577rs11568046等位基因C/TA/GC/TA/GC/TC/TA/CC/T观察组498A792496481783294344167127B146488509205680628819847对照组506A825458482799303349175124B183542528211707661825880χ2值8.080.260.950.170.0450.160.380.42P值0.004*0.630.350.690.850.750.550.53OR1.281.031.061.0311.030.961.0695%CIlower1.080.920.940.90.870.910.830.82upper1.521.181.211.221.131.161.131.12

3 讨论

SNPs是染色体DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNPs数量多、分布广，每个个体至少携带300万个SNPs；SNPs的存在稳定且容易筛查，每一代中每个核苷酸变异随机，这种变异是二态性标记，非此即彼，有利于实现高通量、自动化筛查和分析。不同SNPs的不同组合，使不同人群具有不同的心脑血管疾病易患性，导致相应疾病的临床表现各异，治疗效果也不同。

目前，AGT基因多态性与高血压的相关性研究比较多，但主要集中在其启动子区域和第二外显子位置上。有研究对AGT 上5个位点( C-532T，A-217G，A-6G，C3889T，M235T)多态性检测后发现，亚裔美国人与欧洲籍美国人均为阴性[7]。而Watkins WS等[8]对高血压患者256 例与正常人126 例开展对照，通过AGT基因检测，24个SNPs位点中有7个相同，部分结果也相近。还有学者认为，AGT基因T/T基因型与脑梗死无关，与脑出血也无关，但会增加ACE基因DD基因型个体患脑梗死的危险性。也有学者认为AGT基因T/T型可能与多发性脑梗死的发病相关。晏玉奎等[9]认为AGT T704Crs699位点多态性可能是小动脉粥样硬化性脑梗死(SA)发病机制的遗传因素,且携带AGTCC基因型、高血压病史和老年患者具有协同致病效应。和姬苓等研究认为肾素REN基因 10631AA基因型和A等位基因以及AGT的T704C基因型和C等位基因可能为脑梗死的易感因素，单倍型T704C-10631A可能是脑梗死发病遗传危险因素；其研究也涉及AGT521T基因型和T等位基因以及单倍型521T-10631A-704C，认为这些位点突变是脑梗死的易患因素[10-11]。崔金环等[12]通过研究我国南方人群认为AGT、血管紧张素转换酶(ACE)和eNOS基因多态性可能是该地区人群脑梗死的遗传危险因素,但在脑梗死的发生中不具有交互作用，并不增加脑梗死发生机率。王埮等[13]研究认为， AGT基因四个位点的SNPs及其构成的单倍型与海南黎族EH并脑梗死的相关性，认为C-18T多态的基因型和等位基因、A-6G 多态的G等位基因均为EH并脑梗死危险因素，单倍型分析提示由-20C和-6G 构成的H6单倍型在EH并脑梗死组中明显增加。张剑平等[14]研究认为M 235T基因多态性是EH合并脑梗死患者发病的遗传危险因素。且有高血压家族史患者的CC纯合子更易患脑梗死。本研究对AGT基因tagSNP位点进行了分析，发现14个位点为阴性，包括M235T等2个位点阳性。