哈蟆油与牛蛙油蛋白质组学差异分析

宿文杰，张玉尧，周 媛，宋柏林，赵大庆，张 鹤,3*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.宁江社区卫生服务中心，吉林 松原 138000；3.长春中医院大学附属医院，长春 130021）

哈蟆油（Ovicutus Rana）为蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）雌蛙的输卵管，为滋补药材之首，具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效。林蛙的输卵管[1]呈现乳白色或黄白色，有脂肪样光泽，手摸滑润，质硬易折断；有特殊的油脂气味和腥味，味微甘，嚼之有黏滑感；膨胀度＞55；其主要成分为蛋白质，含量约占50%以上[2]。伪品牛蛙的输卵管为不规则弯曲，管径不均一，不透明的暗黄色，无光泽手摸无滑腻感，质地较硬、脆。牛蛙油温水浸泡膨胀度＜30，粗蛋白含量为39.96%～47.50%[3]。在目前研究中，伪品牛蛙的输卵管从性状、显微、薄层色谱等方面与哈蟆油均可辨别区分。目前研究哈蟆油中特异性的成分除1-甲基海因外[4]，鲜有特异性成分发现。本文采用iTRAQ 技术比较哈蟆油和牛蛙油的蛋白质表达差异，对这些差异蛋白进行功能分析和代谢通路分析，筛选两个种属蛙在冬眠前输卵管蛋白组成的差异，进而发现这些差异蛋白与生长环境、发育的关系。

1 材料和方法

1.1 样品采集 林蛙采于蛟河市前进乡、永吉县北大湖镇、舒兰市上营镇、桦甸市红石砬子镇、集安市清河村、安图县三道湾镇，牛蛙采自于福建省漳州市。

1.2 主要仪器和试剂 Q-Exactive 质谱仪，Thermo Finnigan 公司；AKTA Purifier 100 纯化仪，600Ⅴ电泳仪，GE Healthcare 公司；5430R 型低温高速离心机，真空离心浓缩仪，Eppendorf公司；胰蛋白酶，promega公司；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit，AB SCIEX 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛙油提取 取活蛙腹部解刨，取两侧输卵管，去掉筋膜、卵等杂质，用蒸馏水清洗干净后低温冷冻干燥，研磨成粉末待用。

1.3.2 蛋白质提取 每组样品称取10 mg，加入1 mL SDT 裂解液，充分匀浆后沸水浴5 min，超声破碎，14 000 g 离心45 min，取上清-80℃保存。SDS-PAGE法测定样品中蛋白含量。

1.3.3 iTRAQ 定量 每份样品各取250 μg，胰蛋白酶消化，酶解后的肽段用8 标iTRAQ 试剂标记113（哈蟆油），114（哈蟆油）和117（牛蛙油）。采用第一维强阳离子交换液相色谱分级，第二维采用纳升流速HPLC 液相系统进行分离，每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析。

1.3.4 差异蛋白筛选 对样本哈蟆油113（A）和114（B）与牛蛙油117（E）中1 220 个蛋白质定量信息进行显著性分析，其中筛选条件标准为比值＞1.5（或比值＜0.67），且P值＜0.05。

1.3.5 生物信息学分析

1.3.5.1 GO 功能注释分析 利用WEGO 软件对鉴定到的差异蛋白进行细胞组分、生物学途径和分子功能分析，计算中GO 选择Level2 进行汇总。

1.3.5.2 KEGG 通路注释 利用KAAS 将目标蛋白序列与KEGG GENES数据库中的两栖纲蛋白序列进行比对，通过同源/相似蛋白的KO号注释到相关KEGG通路上。

2 结果

2.1 牛蛙油与哈蟆油差异蛋白筛选的结果 见表1，见表2。

表1 牛蛙油与哈蟆油相比上调的蛋白质

表1 （续）

表2 牛蛙油与哈蟆油相比下调的蛋白质

2.1.1 牛蛙油含量较高的特异性蛋白 从表1 可以看出，牛蛙油与哈蟆油蛋白质组数据分析中上调的蛋白质共计69 个。其中参与生长发育相关的Ada2、Fam3c、Ovch2、Ahnak、Cp、Nup93、Calm2、Capns2、H2az2、H3.2、TGas113e22.1、H2A-IX、Eef1A、Arl1、Iebf2 等；参与能量代谢的蛋白包括Hadhb、Atp5g1、Aldoc 等；参与应激反应的蛋白包括Ldha、Hyou1、Cp、Hpx、Hsp90b1、HSP90B1 等；参与骨架形成的蛋白包括Keratin、Actin、Cfl1、Tubulin等；参与信号转导的蛋白包括Psme1、Psma7-b、TM9SF1、Sort1 等；参与免疫调节的蛋白包括Mug2、ColIA1、ColIA2、ColⅤA1 等；参与氧化还原的蛋白包括Prx、Sqor 等。

2.1.2 哈蟆油含量较高的特异性蛋白 从表2 可以看出，牛蛙油与哈蟆油相比下调的蛋白质有8 个，其中参与免疫调节的蛋白包括Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 和tPCase 等。

2.2 GO 注释分析结果 利用WEGO 软件对鉴定到的差异蛋白功能类别进行GO 功能富集计算。在Level 2水平上对差异蛋白在细胞组分、生物学途径和分子功能中分布情况进行分析。见图1。

从图1 细胞组分中可以看出差异蛋白主要集中在细胞、细胞器、大分子复合体和胞外区等9 个蛋白类，其中细胞、细胞器类和大分子复合体蛋白质的数量最多，分别占所有差异蛋白质的27.92%、22.08%和16.88%。

从图1 生物学途径中看出，细胞过程、代谢途径、单一生物过程、生物调节、定位途径、繁殖途径、生长过程和运动过程等是差异蛋白质比较集中的17 个生物学途径。其中细胞过程、代谢途径、单一生物过程和生物调节类蛋白质数量较多，分别占所有差异蛋白的17.98%、16.10%、14.61%和10.86%。

图1 牛蛙油与哈蟆油差异蛋白GO 分析

从图1分子功能中可以看出结合功能、催化活性、结构分子活性、受体活性、抗氧化活性、酶调节活性等是差异蛋白质比较集中的11 个分子功能。其中结合功能与催化活性类蛋白质数量最多，占所有差异蛋白质的51.04%和29.17%。

2.3 KEGG 代谢通路分析 牛蛙油与哈蟆油的差异蛋白总数为77 个，共提取到41 个差异蛋白map 到100条KEGG 信号通路。41 个差异蛋白中包括40 个上调蛋白map 到99 个KEGG 代谢通路和1 个下调蛋白map 到1 个KEGG 代谢通路。

与哈蟆油蛋白质数据比，牛蛙油中含量较高的Calm2 参与Rap1 信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号通路、钙信号通路等30 个代谢通路；Aldoc 参与糖酵解、糖异生、果糖和甘露糖等7 个代谢通路；Hadhb参与脂肪酸延长、脂肪酸降解、脂肪酸代谢等5 个代谢通路；Ldha 参与糖酵解、糖异生、丙酮酸代谢、丙酸盐代谢4 个代谢通路。

哈蟆油中含量较高的1 个差异蛋白tPCase 参与氨基糖和核苷酸糖代谢过程。

3 讨论

3.1 生活习性差异 中国林蛙是典型的水陆两栖性生物，它的年生活周期可分为水生生活期和陆生生活期[5]。中国林蛙冬眠分为3 个阶段：入蛰期、散居冬眠期、冬眠活动阶段[6]。冬眠前机体营养储备充足，为长期休眠和翌年的排卵提供良好的营养条件。冬眠期蛙类机体的营养水平、代谢水平、内分泌水平等都处于最低水平，减少能量的消耗[7]。

牛蛙的适应能力强，生长速度快，蛋白质含量高等优点，具有较高的食用和经济价值。由卵孵化成蝌蚪，由蝌蚪变化到成体，共需4～5 年；气温降至10 ℃以下，牛蛙开始藏匿于洞穴或淤泥中，停止活动与摄食，进入冬眠期。多数牛蛙均为南方养殖，因此冬眠期较短[8]。冬眠前机体的能量富集以维持蛙冬眠的整个阶段和冬眠后的繁殖。由于中国林蛙与牛蛙的生活习性的不同，通过比较牛蛙油和哈蟆油蛋白质组数据库，筛选两个种属蛙在冬眠前输卵管蛋白组成的差异，进而发现这些差异蛋白与生长环境、发育的关系。在牛蛙油中高表达的69 个蛋白质主要参与生长发育、能量代谢、应激反应、细胞骨架形成、生物合成、信号转导、免疫调节和氧化还原等过程。而在哈蟆油中高表达的蛋白质有8 个，主要参与免疫调节等过程。

3.2 哈蟆油特异性膨胀度 哈蟆油具有较高的膨胀度是哈蟆油区别于其他伪品蛙油的重要的鉴别方法。本文通过筛选发现黏蛋白类成分Muc2、Muc5AC、Muc5B 和类似黏蛋白Fcgbp 在哈蟆油中含量较高，这三种类型的黏蛋白属于凝胶形成型的黏蛋白，高度糖基化的黏蛋白具有相当的保水能力，并通过吸收大量水分形成凝胶[9]；黏蛋白结构中包含半胱氨酸富含区域中，C 端D 结构域形成二硫键连接形成二聚体，N端的D 结构域形成二硫键参与的三聚体，进而形成黏蛋白的分子量较高不溶于水的特点[10]。因此哈蟆油具有较高的膨胀度与哈蟆油中含量较高的黏蛋白类成分密切相关。

3.3 结论 由于中国林蛙与牛蛙的生活习性的不同导致哈蟆油与牛蛙中蛋白质含量的差异，本研究通过比较牛蛙油与哈蟆油蛋白质组数据的差异，筛选哈蟆油中含量较高的8 个差异蛋白主要参与免疫调节等过程；牛蛙油中含量较高的69 个差异蛋白主要参与生长发育、能量代谢、应激反应、细胞骨架形成、信号转导、免疫调节和氧化还原等过程；其中Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 等8 个高表达的蛋白可作为哈蟆油区别于牛蛙油的重要蛋白质，同时哈蟆油的特异性膨胀度可能与含量较高的黏蛋白类密切相关，本文的研究结果为进一步研究哈蟆油的功效成分奠定基础。