合成甲基营养细胞工厂同化甲醇的研究进展及未来展望

2021-05-22张卉袁姚梦张翀杨松邢新会

合成生物学 2021年2期

张卉，袁姚梦，张翀，杨松，5，邢新会

（1 青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109；2 青岛农业大学，山东省应用真菌重点实验室，山东青岛266109； 3 清华大学化学工程系生物化工研究所，工业生物催化教育部重点实验室，北京 100084；4 清华大学合成与系统生物学研究中心，北京 100084；5 青岛农业大学，青岛生物沼气环境微生物国际合作基地，山东青岛 266109）

生物经济成为绿色可持续产业和社会发展的重要模式，其核心是生物制造。然而，不可再生的化石资源和与人争粮的糖基原料已经难以作为最优原料支撑工业生物制造的应用发展［1］，同时木质纤维素原料目前仍存在预处理技术和经济性的局限，因此寻找合适的非糖替代原料是生物制造的重要挑战［2］。廉价和来源广泛的有机碳一原料甲醇，主要可以由煤和天然气生产，并且通过沼气或城市固体废物产生的二氧化碳与电解生成的氢气进行反应获得可再生的甲醇［3-5］。与传统的糖基原料相比，甲醇具有更高还原性，可作为碳源生产包括长链醇、有机酸和碳氢化合物在内的高附加值的化学物质［6-7］。

自然界中存在大量以甲醇为碳源的甲基营养型微生物，其独特的代谢机制使得它们能够以甲醇为唯一碳源和能源合成细胞生长需要的物质和能量［8-9］。目前，自然界发现的利用甲醇的甲基营养型微生物主要包括甲基细菌和酵母菌，这些甲基微生物可以利用不同类型的甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenases，Mdhs），包括吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone， PQQ）依赖的Mdhs［10］、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖的Mdhs［11］、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的醇氧化酶（Aods）［12］。尽管利用天然甲基营养型细菌将甲醇转化成甲羟戊酸［13-14］、3-羟基丙酸［15］和蛇麻烯［16］等化学产品的研究已经取得一些进展，但由于存在遗传背景不完全清楚、遗传工具相对较少以及甲醇利用率偏低等局限，制约了天然甲基营养型细菌的广泛应用发展［17-18］。近年来，以遗传操作与工程化改造更为便捷的模式底盘微生物为基础，将其代谢网络重塑为能以甲醇作为碳源合成高附加值化学品的合成甲基营养细胞工厂成为重要发展方向。现有的研究一般利用模式底盘微生物（大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母等），通过引入天然甲基营养型微生物的甲醇同化途径［19］，包括丝氨酸循环途径（serine cycle）、核酮糖单磷酸途径（ribulose monophosphate cycle，RuMP）、木酮糖单磷酸途径（xylulose monophosphate cycle， XuMP）或核酮糖二磷酸途径（ribulose bisphosphate cycle， RuBP）构建合成甲基营养细胞工厂，其中存在于天然甲基营养型微生物中的RuMP 能够通过3-己酮糖-6-磷酸合成酶（3-hexulose-6-phosphate synthase， Hps）直接将甲醇氧化产物甲醛与核酮糖-5-磷酸（Ru5P）缩合生成己酮糖-6-磷酸（H6P），该过程可更高效利用辅因子及能量，被认为是十分有效的有机碳一同化途径［20］。本文系统综述了合成甲基营养细胞工厂的关键生物元件、核酮糖单磷酸途径（RuMP）构建与甲醇同化途径设计优化的研究现状，进而结合合成甲基营养细胞工厂面临的机遇和挑战，对未来的研究方向进行展望。

1 合成甲基营养细胞工厂中甲醇氧化、同化基因及其调控元件

合成甲基营养细胞工厂中氧化甲醇的第一步反应，一般选用来源于革兰氏阳性天然甲基营养菌且NAD 为辅助因子的Mdhs。主要原因是NAD依赖的Mdhs 在好氧和厌氧条件下都能将甲醇脱氢产生电子，用于生成代谢产物［21］。然而，该类Mdhs 催化甲醇活性偏低是合成甲基营养细胞工厂构建的一个重大瓶颈［22-24］，亟需开发更加高效的Mdhs。Witthoff 等［25］首先在谷氨酸棒状杆菌中构建了RuMP途径，发现异源表达来源于甲醇芽孢杆菌（Bacillus methanolicus）的Mdh 和内源激活蛋白（endogenous activator protein，Act）效果最佳。在大肠杆菌中，Müller 等［26］发现了来自甲醇芽孢杆菌（B. methanolicus）的Mdh2 最有效。随后，Wu 等［27］首次发现源于非甲基营养菌的钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator N-1）中的Mdh2 在大肠杆菌中具有催化活性，并且通过酶定向性进化Mdh2，使其对甲醇催化效率提高6 倍。Whitaker等［22］也发现非甲基营养的嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）中的Mdh在大肠杆菌中具有一定催化活性，其氧化甲醇的Km值较低，更加有利于甲醇氧化。最近，为了解决Mdhs 催化效率低的问题，Roth 等［28］用甲醛传感器开发噬菌体辅助非连续进化（PANCE）方法，对来自甲醇芽孢杆菌的Mdh2 进行进化，使其催化活性提高3.5 倍，为Mdhs 进一步改造提供了理论基础。甲醇氧化生成的甲醛，可以被RuMP途径中的Hps和6-磷酸-3-己酮糖异构酶（Phi）同化进入下游中心代谢。需要注意的是，除了Mdh、Hps 和Phi 之外，近年来还有研究报道通过计算并加以人工设计改造的酶，如甲醛酶（Fls）［29］和乙醇醛合成酶（Gal）［30］构建全新的代谢路径实现甲醛同化进入下游代谢。

研究者还发现通过蛋白组装策略构建的多酶复合物，可以快速固定甲醛，显著提高甲醇利用效率。例如，Price 等［31］利用无支架的蛋白自组装策略，使用SH3 配体的相互作用获得Mdh-Hps-Phi的工程化超分子酶复合物，使得体外果糖-6-磷酸（F6P）的产量提高了97 倍，最终的甲醇体外消耗速率提高了2.3倍。同样，Fan等［32］通过融合蛋白策略，将嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）来源的Mdh 与甲醇芽孢杆菌（B. methanolicus MGA3）来源的Hps 和Phi 进行融合表达，利用最优柔性连接肽（GGGGS）3和（GGGGS）6连接Mdh、Hps 与Phi，形成的融合蛋白酶提高了甲醇氧化及转化成F6P 的效率。在Mdh-Hps-Phi 多酶复合物的级联反应中，通过酶复合物降低了酶分子的空间距离，提高甲醛转化成F6P的代谢效率，强化了甲醇消耗。

此外，在合成甲基营养细胞工厂中，甲醇被Mdhs 氧化产生甲醛，而甲醛对细胞具有毒性，因此，甲醛诱导型启动子（Pfrm）对于细胞工厂的构建十分重要。Pfrm是大肠杆菌中的天然启动子，受FrmR 蛋白的负反馈调控，只有在甲醛存在条件下，FrmR 才会优先与甲醛结合，从而解除对启动子Pfrm抑制，启动下游基因表达［33-34］。利用这一特点，Rohlhill 等构建了基于Pfrm诱导基因表达盒（mdh-hps-phi）表达的质粒，避免了甲醛胞内积累，实现了对mdh-hps-phi 操纵子的动态调控［35］。

2 合成甲基营养细胞工厂中构建RuMP同化甲醇

天然甲基营养细胞工厂中的RuMP主要包括三个模块：包含Hps 和Phi 的甲醛固定模块；将F6P转化成C3中间代谢物丙酮酸的转化模块；甲醛受体Ru5P 再生的碳重排模块，其中高效的甲醛受体再生是甲醇同化的关键所在［5，23，36］。由于典型底盘细胞工厂拥有完整的糖酵解途径和三羧酸循环途径，在其中引入天然甲基营养型微生物RuMP关键基因mdh、hps和phi，利用其代谢产生的中间产物，并以糖基碳源作为辅助碳源，可以实现对甲醇的氧化同化。目前的研究策略主要包括：增强甲醛受体再生；共用糖基碳源结合实验室适应性进化策略增强甲醇同化；合成甲基营养细胞工厂中甲醛代谢和还原力动态调控。

2.1 增强甲醛受体再生

合成甲基营养细胞工厂中甲醛受体Ru5P 不足是限制甲醇同化效率的关键原因，阻断F6P 进入氧化型磷酸戊糖途径的代谢流，提高非氧化戊糖磷酸途径（non-oxidative pentose phosphate pathway， PPP）相关基因的表达，是增强Ru5P再生的一种策略。此外，异源表达编码果糖二磷酸醛缩酶（Fba）和景天庚酮糖二磷酸酶（Glpx）的基因（图1），并结合提高本源的6-磷酸果糖激酶（Pfk）、转酮酶（Tkt）、核酮糖磷酸差向异构酶（Rpe）和核糖磷酸异构酶（Rpi）的表达量，是增强Ru5P 再生的另一策略。基于这些策略，Bennett 等［36-38］在合成甲基营养细胞工厂构建时，敲除编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi，阻断了F6P 进入氧化型磷酸戊糖途径的代谢流，并过表达甲醇芽孢杆菌中编码五种酶（Pfk，Fba，Glpx，Rpe 和Tkt）的基因，强化了Ru5P 的前体物供给，从而显著改善了甲醇在大肠杆菌中的同化效率。同样，Woolston 等［23］过表达编码Glpx 的基因，并利用小分子抑制剂（碘乙酸盐）减少糖酵解途径代谢流量，同样提高了甲醇同化进入大肠杆菌中心碳代谢的效率。最近，Rohlhill 等［39］利用甲醛诱导启动子Pfrm过表达pfk、fba、glpx、rpe 和tkt，实现动态调控Ru5P 再生，促进甲醇同化过程。

2.2 共用糖基碳源结合实验室适应性进化策略强化甲醇同化

图1 基于共用糖基碳源的合成甲基营养细胞工厂构建的代谢途径［36-38，41-45］（蓝色指示代表RuMP途径；橘色，紫色和灰色号分别指示在合成甲基营养细胞工厂构建中敲除edd、rpi和maldh，并以葡萄糖酸为共用糖基的代谢途径，敲除edd、rpi和pgi并以葡萄糖为共用糖基的代谢途径以及敲除rpi以木糖为共用糖基的代谢途径；绿色指示代表异源表达glpx和fba的基因；红色指示代表亮氨酸响应调控蛋白的调控，其中“+”代表激活途径，“－”代表抑制途径）Fig.1 The construction of the synthetic methylotrophic cell factory based on the sugar as the co-substrate[36-38,41-45][The blue represents the Rump pathway; the orange, purple and gray represent the metabolic pathway of knocking out genes (edd, rpi and maldh) based on the gluconate as the co-substrate, knocking out genes (edd, rpi and pgi) using glucose as the the co-substrate, knocking out the gene rpi based on the xylose as the co-substrate, respectively; the green represents the heterologous expression of genes glpx and fba. The red represents the regulation of leucine-responsive protein, in which "+" represents the activation pathway and "－" represents the inhibition pathway]

由于在合成甲基营养细胞工厂中引入RuMP途径的代谢通量偏少，目前研究者普遍以添加糖基碳源结合实验室适应性进化（adaptive laboratory evolution，ALE）策略构建甲醇利用的合成甲基营养细胞工厂［40］。其中，共用的糖基碳源被用于生成Ru5P，而甲醇主要提供合成甲基细胞中心代谢所需的碳源。因此，根据不同共用糖基碳源的代谢途径，计算模拟设计出不同的营养缺陷菌株，进而结合ALE 策略以增强合成甲基营养细胞工厂利用甲醇的代谢通量。Meyer 等［41］首先基于模拟代谢网络分析，发现在大肠杆菌底盘中敲除编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因edd 和编码核糖磷酸异构酶的基因rpi（图1）且引入甲醇同化途径，以葡萄糖酸为共用糖基碳源，并加入0.1 g/L 酵母粉和20 mmol/L 丙酮酸作为辅助碳源，通过传代培养初次获得依赖甲醇生长的进化菌株MeSV1.1。随后，通过敲除进化菌株MeSV1.1 编码苹果酸脱氢酶的基因maldh 以平衡胞内氧化还原状态，进而获得更依赖甲醇生长的适应性进化菌株MeSV2.1和MeSV2.2。而最终进化菌株MeSV2.2在5 mmol/L 葡萄糖酸和500 mmol/L 甲醇作为碳源的情况下，培养100 h后OD600达到1.3，甲醇消耗速率达到了（13±7）mmol/（g·h）（以CDW计），接近天然的甲基营养菌。Bennett 等［42］以葡萄糖为共用糖基碳源，使进化的大肠杆菌获得甲醇依赖性生长的特性，进化菌株的比生长速率可以达到0.15 h－1。Chen 等［43］以木糖为共用糖基碳源时，通过ALE 实验，进化菌株能够以等摩尔比消耗甲醇和木糖，获得0.17 h－1的比生长速率。Tuyishime 等［44］以木糖为甲醇依赖生长工程菌的辅助糖基碳源，最终在谷氨酸棒杆菌进化菌株MX-11 中实现部分利用甲醇合成谷氨酸。此外，有研究者发现某些氨基酸（如苏氨酸）作为甲醇的共同利用底物，可以明显提高甲醇利用效率，而且激活氨基酸的代谢途径（即敲除亮氨酸响应调控蛋白Lrp），也可以提高合成甲基营养细胞工厂同化甲醇效率（图1）［45］。除此之外，表1［46］总结了目前合成甲基营养细胞工厂构建中，共用糖基碳源增强甲醇同化的研究进展。不同于上述工作，Liao 课题组2020 年最新研究报道利用代谢途径理性设计与适应性进化策略，首次实现大肠杆菌底盘中构建的合成甲基营养细胞工厂能够以甲醇作为唯一碳源和能源进行生长，最终获得的进化菌株倍增时间8.5 h，进化菌株SM1 在72 h 内生物量OD600值达到2［24］。

实验室适应性进化的结果如表2 所示，进化菌株突变基因的基本特点是降低了利用共用糖基碳源的相关酶催化活性，从而实现降低本源的碳代谢途径和能量代谢途径（如糖酵解途径、Entner-Doudoroff 途径和TCA 循环）的代谢流，以维持胞内碳代谢流和氧化还原的平衡状态。值得注意的是Liao 课题组近期研究结果也发现甲醛脱毒途径相关基因的突变，即进化菌株CFC526.16 编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因发生SNP 突变，调低了Entner-Doudoroff 途径代谢通量，从而实现RuMP 途径、糖酵解途径和磷酸戊糖途径的代谢平衡。此外，该研究还发现在进化过程中存在插入序列介导的基因组上基因拷贝数动态变化现象，一段富含甲醇同化途径和糖异生途径所需基因的DNA 大片段（约70 kb）随着细胞进化代数增加而相应增加片段拷贝数，这一动态变化是与进化菌株的高效甲醇同化代谢过程相一致的［24］。

表1 共用糖基碳源增强甲醇同化Tab.1 Enhancement of methanol assimilation based on the sugar as the co-substrate

表2 甲醇依赖菌株通过ALE获得的有利突变Tab.2 Summary of mutations obtained by adaptive laboratory evolution in synthetic methanol-dependent strains

2.3 合成甲基营养细胞工厂中甲醛代谢和还原力动态调控

在合成甲基营养细胞工厂构建中，引入异源Mdhs 不仅生成甲醛，还会伴随还原力（还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）的产生。从热力学角度分析，NADH 的积累会增加催化反应的吉布斯自由能，不利于合成甲基营养细胞工厂氧化甲醇的第一步反应。在以糖基作为碳源生长时，TCA 循环同样也产生NADH，而天然甲基营养型细菌普遍缺少完整的TCA 循环，这就有利于NADH 平衡，而且有研究证明较低代谢活性的TCA 有利于甲醇同化［20］。基于此，Keller 等［40］在开展进化甲醇依赖菌株研究时，通过代谢流平衡分析（FBA）证实在葡萄糖酸盐和甲醇的双碳源下，生长不需要完整的TCA 循环，进而将TCA循环中依赖于NADH 的苹果酸脱氢酶（Maldh）的基因敲除，以增加进化菌株对甲醇的依赖性。同样，Rohlhill 等［39］也将干扰甲醛代谢的基因maldh 敲除，并使用甲醛诱导型启动子Pfrm调控磷酸戊糖途径的rpe 和tkt 基因表达。除此之外，为了克服NADH 积累，驱动甲醇氧化，Price 等［31］利用蛋白质工程手段改造RuMP 关键酶活性时，使用大肠杆菌来源的乳酸脱氢酶（Ldh）催化丙酮酸，从而循环再生NAD+（图2）以促进甲醇转化。在合成甲基营养细胞工厂构建中，多余的NADH 通过转化酶再生为NADPH，从而有利于生产赖氨酸［47］和1，3-丙二醇［48］等高消耗NADPH的化学品。

图2 细胞工厂内甲醛代谢和还原力的动态调控Fig.2 Dynamic regulation of formaldehyde metabolism and reducing power in the cell factory

3 其他途径在合成甲基营养细胞工厂中同化甲醇的应用

除了RuMP途径，还可以引入并改造丝氨酸循环途径和XuMP 途径构建合成甲基营养细胞工厂。而且，有研究者通过计算设计出简化有机碳一同化途径的新颖酶，通过人工合成甲醇利用途径以实现甲醇的高效利用。

Liao 课题组［49］首先在大肠杆菌中重构扭脱甲基杆菌（Methylorubrum extorquens）的丝氨酸循环途径，以木糖作为共底物碳源，实现1分子甲酸和1 分子碳酸氢盐生成1 分子乙酰辅酶A，该过程消耗3 分子ATP 和1 分子NADH。最近，Bar-Even 课题组［50］构建的高丝氨酸循环途径是依赖于大肠杆菌本源丝氨酸醛缩酶（serine aldolase， SAL）和4- 羟基-2- 氧代丁酸酯醛缩酶（4-hydroxy-2-oxobutanoate aldolase， HAL）的两个混杂甲醛醛缩醛酶反应，该途径只消耗1分子ATP生成乙酰辅酶A，其效率优于改良的丝氨酸循环。在XuMP途径重构的研究中，姜岷教授课题组初次在酿酒酵母细胞基因组上整合毕赤酵母甲醇代谢途径，实现酿酒酵母同化甲醇以增加生物量［51］。

Bogorad 等［52］将非氧化糖酵解（NOG）与RuMP 途径相结合，将甲醇转化为乙酰辅酶A，形成了一种不依赖ATP 的非氧化糖酵解甲醇缩合途径（MCC）。基于计算设计的甲醛酶（Fls）途径、合成乙酰辅酶A（SACA）途径和2-羟酰基辅酶A裂解酶（Hacl）途径都是能够代谢甲醛的线性途径，是甲醇同化的可行性选择［29，30，53］。其中，合成SACA途径是现有途径最短、ATP非依赖和氧气不敏感的甲醇同化途径，可获得体外50%的甲醇同化效率［30］。最近，中国科学院天津工业生物技术研究所的马延和研究员课题组通过计算筛选出苯甲酰甲酸酯脱羧酶（Gals）和转醛缩酶（TalBF178Y）两种工程酶进行人工反应，构建了新的体外C1同化途径（乙醇醛同化途径），优化该途径使其碳效率达到88%［54］。

总之，计算设计获得新颖途径能力的不断增强，可以加快碳同化效率，减少能量消耗，为高效同化甲醇合成甲基营养细胞工厂的工程化改造提供新思路。

4 合成甲基营养细胞工厂面临的挑战及未来展望

合成甲基营养细胞工厂的构建，是基于天然甲基营养型微生物，借鉴其转化和利用甲醇的代谢机制，利用工程化方法改造底盘细胞，从而构建甲醇依赖型合成甲基营养菌株。由于模式底盘细胞的遗传背景清晰、遗传操作工具丰富、可工程化利用的生物元件成熟，蛋白质工程改造和代谢产物生物传感器的不断发展，为合成甲基营养细胞工厂的创制提供了基础保障［55-56］。

最近Liao 课题组突破性获得以甲醇作为唯一碳源和能源生长的大肠杆菌进化菌株［24］，为深入研究合成甲基营养细胞工厂起到重要的推动作用。不过相比于天然甲基微生物倍增时间为3～4 h，合成甲基细胞工厂生长效力还显著偏低［24］，如何进一步提高其生长速率和生物量得率，以实现合成甲基细胞工厂高效催化甲醇转化成高附加值化学产品仍是研究焦点。目前以甲醇为唯一碳源和能源的合成甲基营养菌株构建面临着巨大挑战，存在三大主要问题亟需解决。第一，甲醇和甲醛等物质对细胞的毒性问题［57］。即使是天然甲基微生物，对有机醇类的耐受也有一定局限［14，58-60］。谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌等非甲基细菌对甲醇耐受性更低，为了解决这个问题，一方面，可以从甲醇依赖的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌的ALE 实验中获得相关基因的突变位点，开展甲醇耐受的组合突变改造；另一方面，可以利用全基因组规模CRISPRi技术开发的高通量基因型和表型关联方法对菌体的耐受机制展开研究，获得提升耐受性的关键功能基因位点［61-62］，此外也可以借鉴其他有机醇的耐受机制加以改造［59］。第二，甲醛和甲醛受体的合理匹配问题。胞内甲醛不足导致RuMP途径同化效率低的问题，可通过蛋白质设计策略和甲醇生物传感器辅助PANCE 的高通量筛选更高效异源Mdhs来解决［28］，而针对甲醛过量积累导致的细胞毒性，可以设计甲醛生物传感器动态调控甲醛合成与同化的代谢过程。而解决甲醛受体再生问题，主要通过精细表达异源RuMP相关基因，或挖掘RuMP潜在局部转录调控子从转录层面进行系统优化调控［19］。第三，理性设计结合ALE，驱动RuMP代谢流合理分配及向下游代谢途径转化。其中，通过增加前体物的含量、敲除旁支途径使得RuMP代谢流在甲醇的选择压力下向下游代谢模块途径拖拽。最近以CO2为碳源的自养型大肠杆菌［63］和酵母菌［64］的研究充分证实理性设计和ALE相结合进行微生物代谢重塑的可行性。

然而，由于ALE 自发突变率很低，需要通过长期连续传代培养以富集突变。近年来，包括CRISPRi［61］、CRISPRa［65］、CREATE［66］在内的CRISPR 技术的迅速发展为在全基因组范围内定制化设计基因型干扰和突变奠定了基础。在连续传代方面，近几年，eVOLVER 作为可定制的自动化细胞培养的集成装置，根据用户需求提供自动化培养生长的实验参数，可以实现快速重新配置以适应几乎所有的自动化连续培养实验［67］。我们自主研发的基于液滴微流控技术的高通量自动化微生物连续培养系统（MMC）［68］，可实现稳定传代100 代，显著提升微生物适应性进化、耐受性表型样本获取的效率。未来需要将基于CRISPR 的全基因组靶向基因编辑技术与高通量自动化ALE 技术结合起来，能够大幅度提升合成甲基营养细胞工厂的构建效率，最终突破目前面临的构建以甲醇为唯一碳源的人工合成甲基营养细胞工厂的“生命暗物质”瓶颈，为发展基于高效合成甲基营养细胞工厂的生物制造提供技术基础。

符号说明

3PG——3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate)

6PG—6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconate)

AcCoA— 乙酰辅酶A(acetyl-CoA)

DHAP— 磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate)

E4P— 赤藓糖-4-磷酸(erythrose 4-phosphate)

Edd— 磷酸葡萄糖酸脱水酶(phosphogluconate dehydratase)

F6P——果糖-6-磷酸(fructose 6-phosphate)

Fba— 果糖二磷酸醛缩酶(fructose bisphosphate aldolase)

G3P—3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate)

G6P— 葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate)

GlpX— 景天庚酮糖二磷酸酶(sedoheptulose bisphosphatase)