耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种筛选及评价指标的鉴定

王吉祥，宫焕宇，屠祥建，郭侲洐，赵嘉楠，沈健，栗振义，孙娟

（青岛农业大学草业学院，山东 青岛 266109）

磷是植物生长发育必需的大量营养元素之一［1］。缺磷会抑制植物体内新细胞的形成，表现为根系发育不良，植株生长受到抑制或停滞［2］。紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培历史悠久，分布面积广泛的多年生牧草，具有产量高、品质优、抗逆性强等特点［3−5］，被称为“牧草之王”［6］。作为豆科植物，紫花苜蓿还可以有效提高土壤肥力［7］。近年来，国家相继出台了“粮改饲”及“振兴奶业苜蓿发展行动计划”等系列工程，进一步推动苜蓿产业的发展［8］。为获取高产优质的苜蓿，过度施用磷肥已成为常态［9−10］。在农业生产中，长期过度施用磷肥引发诸多问题：第一，磷资源浪费，磷肥施入土壤容易被土壤固定［11−13］，植物对磷肥的当季利用率只有 15%～25%［14−15］，磷资源作为一种不可再生资源，在全球的磷酸盐储量十分有限［16−17］，我们必须充分利用有限的磷资源来维持甚至提高当前的农业生产力［18−19］。第二，磷盈余导致环境污染，大量的施用磷肥使土壤成为无效的天然磷库，同时在雨水的淋失作用下，一部分的可溶性磷进入水体造成水体富营养化，对环境造成严重污染［9，11，20−22］。因此，寻找高效磷源成为缓解当前磷肥利用率低、减少环境污染的重要措施之一。

在探索正磷酸盐磷肥替代物的过程中，人们发现了正磷酸盐（H2PO4−）的一种还原形式−亚磷酸盐（H2PO3−）。亚磷酸盐作为磷的载体，具有溶解度高、与土壤成分反应活性低、运输效率高等特点［9］。亚磷酸盐可以作为一种缓释磷肥为植物提供养分［9，23］。亚磷酸在土壤中可以被土壤微生物氧化成正磷酸盐，暴露于空气中，也可以逐渐被氧化成正磷酸盐，从而为作物提供磷营养［24−25］。缓释磷肥，可减少土壤对磷的固定，尽可能发挥磷肥后效，提高磷肥利用率［26−27］。亚磷酸盐在防治植物疫病过程中也发挥重要作用，叶面喷施亚磷酸盐可控制牛油果（Butyrospermum parkii）根腐病的发生，有效地减少农药的使用［28］，这使得亚磷酸盐作为一种新型的多功能磷肥成为可能。有研究表明，亚磷酸盐能加速缺磷油菜（Brassica napus）悬浮细胞的程序性死亡［24］，亚磷酸盐大量代替磷酸盐会导致植株缺磷，抑制植物的生长及光合作用［29］。也有研究表明亚磷酸盐可延长植物生育期，对产量的提高［30］、茎叶生长［31］、根系发育［32］、开花数量［33］和果实大小［34］等有一定的积极作用。

目前我国紫花苜蓿多种植在贫瘠土壤环境中，需要施入大量磷肥获得优质高产的牧草。为减少磷肥浪费，充分利用有限的磷资源，探索亚磷酸盐来替代正磷酸盐作为磷肥具有重要意义；同时，通过探索不同品种紫花苜蓿本身耐亚磷酸盐遗传特性，选育耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种，是探索利用新型亚磷酸盐磷肥的一种有效手段，合理选择耐亚磷酸盐鉴定指标则是进行耐亚磷酸盐育种和耐亚磷酸盐机理研究的基础。本试验将37 个紫花苜蓿品种幼苗置于砂土装置培养，在亚磷酸盐胁迫的条件下，通过多元分析的方法，对紫花苜蓿幼苗的耐亚磷酸盐特性进行综合评价，根据测定指标与耐亚磷酸盐特性的关系建立紫花苜蓿苗期耐亚磷酸盐特性评价回归模型，以期为紫花苜蓿幼苗耐亚磷酸盐品种选育提供种质资源，为耐亚磷酸盐特性评价提供快捷的方法和科学的理论依据，并为亚磷酸盐新型磷肥的开发提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试材料为37 个国内外紫花苜蓿品种（表1），所有品种均由青岛农业大学草地农牧业研究中心提供。

1.2 试验设计

本试验以上述37 个品种的紫花苜蓿为研究对象，河砂作为基质，利用砂培装置对苜蓿幼苗进行培养。将河砂先用清水冲洗干净后多次用蒸馏水冲洗，直到pH 为6.0。挑选健康饱满的紫花苜蓿品种种子各100粒，利用75%酒精进行消毒后均匀摆放在培养皿中，加蒸馏水，置于植物生长箱（E7/2，Conviron，加拿大）中进行萌发，并设置温度为24 ℃，光照强度为200 μmol·m−2·s−1，光照 16 h，黑暗 8 h。

在培养箱中培养一周后，选取长势一致的苜蓿幼苗移入32 孔育苗盘中在温室条件下进行砂培，根据前期预实验，使用1/2 Hoagland 营养液，为保证养分充足，每5 d 浇一次营养液，根据育苗盆大小，浇灌最大容量营养液2 L。先在正常条件下培养15 d，之后分别进行正磷酸盐（0.5 mmol·L−1KH2PO4）（对照）和亚磷酸盐（0.5 mmol·L−1KH2PO3）处理［35−36］。

表1 紫花苜蓿品种Table 1 The alfalfa cultivars

1.3 相应指标的测定与方法

处理15 d 之后测定相关形态和生理指标，每个品种取3 株长势均一的幼苗，4 次重复。

以育苗盆平面为零刻度，用直尺测量植株株高；用数显游标卡尺（111−103B，广陆数测）测定植株基部茎粗；用手持叶绿素荧光仪SPAD（502Plus，日本）测定植株第3 片真叶叶绿素含量；用便携式光合测量系统Li-6800（LI−COR 公司，美国）测定苜蓿幼苗第3 片真叶净光合速率（net photosynthetic rate，Pn），测定过程中，光强为150 μmol·m−2·s−1，温度为 25 ℃，CO2浓度为 400 μmol·mol−1；将植株从育苗盆中取出，用蒸馏水清洗幼苗根部砂砾，用吸水纸吸干植株表面，将苜蓿幼苗地上部和根部分离，分别测定植株地上部与根部鲜重；将根部均匀舒展，置于扫描仪中扫描根部，利用万深LA-S 根系分析系统分析总根长和根表面积；将地上部与根部分别装于信封中，65 ℃烘干72 h 后测定茎叶干重和根干重，根冠比=根干重/茎叶干重；将烘干后的植株样品研磨后，采用钼锑抗比色法［37］分别测定植株地上部与根部磷含量。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2019 进行数据整理和分析；采用SPSS 24.0 和SAS 9.4 软件进行主成分分析、聚类分析及逐步回归等多元分析。相关计算参考杨春婷等［38］、戴海芳等［39］的方法，根据37 个苜蓿品种正常供磷与亚磷酸盐处理各性状数据进行均值差异显著性分析。

1.4.1 各测定指标耐亚磷酸盐系数（phosphite tolerant coefficient，PTC）［38−39］

1.4.2 各综合指标的权重［38−39］

式中：Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重（index weight）；Pj代表经主成分分析所得各紫花苜蓿品种第j个综合指标的贡献率（contributive ratio，%）。

1.4.3 不同品种紫花苜蓿各综合指标的隶属函数值［38−39］

式中：Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个指标的最小值；Xmax表示第j个指标的最大值。

1.4.4 各品种紫花苜蓿的综合评价［38−39］

式中：F（Xj）为第j个综合指标值；aij为各单一指标的特征值所对应的特征向量；Xij为各单一指标的标准化处理值。

1.4.5 各紫花苜蓿品种的综合耐亚磷酸盐能力的大小［38−39］

式中：D值为各品种紫花苜蓿在亚磷酸盐胁迫条件下由综合指标评价所得的耐亚磷酸盐特性综合评价值。

2 结果与分析

2.1 各品种紫花苜蓿单项指标的耐亚磷酸盐系数及相关性分析

利用形态或生理指标的相对值可以消除品种间的固有差异，相比绝对值更能准确反映紫花苜蓿耐亚磷酸盐能力的强弱。根据公式（1）计算各测定指标的相对值即耐亚磷酸盐系数（PTC）。不同品种紫花苜蓿经亚磷酸盐胁迫处理后（表2），所测得的12 个指标中有10 个指标（包括株高、茎粗、茎叶磷含量、茎叶干重、根干重、根冠比、总根长、根表面积、叶面积和光合速率）均有所下降，表现为PTC＜1，根磷含量和叶绿素含量有所增加，表现为PTC＞1，不同品种紫花苜蓿各指标的变化幅度不同，因此，用多个单项指标来评价紫花苜蓿的耐亚磷酸盐特性，会得到不同的结果且不准确、不直观。

为了解试验中的指标信息是否存在重叠，进一步分析了不同指标间的相关性，生理指标之间的相关性分析能够解释各指标间是否存在依存关系和相关关系的方向与强度［40］。各指标之间存在不同程度的相关性，这说明各指标所提供的信息发生了相互重叠（表3）。综合不同品种的紫花苜蓿各单项指标的变化情况（表2）可知，株高与茎粗、茎叶干重存在相关性且差异极显著，相关系数分别为0.49、0.43；茎粗与茎叶干重、根冠比存在相关性且差异极显著，相关系数分别为0.47、−0.43；茎叶磷含量与根干重、根磷含量存在相关性且差异显著，与叶面积存在相关性且差异极显著，相关系数分别为−0.34、0.34、0.52；茎叶干重与根冠比、根磷含量存在相关性且差异极显著，相关系数分别为−0.43、−0.46；根干重与根冠比、总根长、根表面积存在相关性且差异极显著，与根磷含量存在相关性且差异显著，相关系数分别为0.68、0.60、0.70、−0.35；根冠比和总根长、根表面积、叶面积存在相关性且差异极显著，相关系数分别为0.54、0.52、−0.43；总根长和根表面积存在相关性且差异极显著，相关系数为0.82；叶面积和净光合速率存在相关性且差异显著，相关系数为−0.40。各单项指标在不同的紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性中所起的作用的大小也不同，表明紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性是一个复杂的综合性状，直接利用各单项指标不能准确和直观地对紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性进行评价。为弥补单项指标耐盐性评价的不足，需在此基础上进一步利用其他多元统计方法进行分析。

2.2 主成分分析

2.2.1 各综合指标载荷系数和贡献率 主成分分析可以在损失较少信息量的前提下，把较多的测试指标转化为少量综合指标，有效地浓缩数据和简化数据，以弥补单项指标对耐亚磷酸盐特性评价的不足。对37 个紫花苜蓿品种的12 个单项指标的耐亚磷酸盐系数进行主成分分析。前5 个综合评价指标（comprehensive index，CI）的贡献率分别为27.86%、21.02%、14.83%、8.74%和7.99%，累计贡献率达80.45%（表4），这样可将原来12 个单项指标转换为5 个新的相互独立的综合指标，并且这5 个综合指标可涵盖原始数据所提供的绝大部分信息。决定第1 个综合指标大小的是根干重、根冠比、总根长、根表面积和叶面积，该综合指标主要反映的是与根系形态有关的指标和叶片形态等方面的信息；决定第2 个综合指标大小的是株高、茎粗、茎叶干重、根干重、根中磷含量和叶绿素含量，该综合指标主要反映的是地上部茎叶的生理形态指标、植株干物质量和植物体内物质含量等方面的信息；决定第3 个综合指标大小的是茎叶磷含量、总根长、根表面积、根中磷含量、叶面积和光合速率，该综合指标主要反映的是植株体内磷含量，根系形态指标和植物光合作用等方面的信息；决定第4 个综合指标大小的是株高和叶绿素含量，该综合指标主要反映的是植株的形态和植物光合作用等方面的信息；决定第5 个综合指标大小的是叶绿素含量和光合速率，该综合指标主要反映的是植物光合作用等方面的信息。

表2 亚磷酸盐胁迫条件下紫花苜蓿幼苗各单项生理指标的耐亚磷酸盐系数Table 2 Phosphite tolerant coefficient（PTC）of each single index of alfalfa seedings under phosphite stress

表3 亚磷酸盐胁迫下紫花苜蓿幼苗各单项生理指标的相关系数矩阵Table 3 Correlation matrix of each single index of alfalfa seedings under phosphite stress

表4 各综合指标的系数及贡献率Table 4 Coefficients of comprehensive index and proportion

2.2.2 隶属函数分析和综合指标值计算 对于同一综合指标如F（X1）而言，经过亚磷酸盐胁迫处理后，先行者的U（X1）值最大，为 1.000，表明此品种在F（X1）表现为高度耐亚磷酸盐特性，而 WL712 的U（X1）值最小，为0.000，表明WL712 在这一综合指标上表现为耐亚磷酸盐特性最差。根据各综合指标的贡献率大小，可用公式（2）计算其权重Wj。经计算，5 个综合指标的权重分别为 0.346、0.261、0.184、0.109 和 0.099（表 5）。

表5 各品种的综合指标值F（Xj）、权重（Wj）、隶属函数值U（Xj）、D 值及综合评价Table 5 The value of each variety’s comprehensive index F（Xj），index weight（Wj），U（Xj），D value and comprehensive valuation

2.2.3 各品种紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性的综合评价及聚类分析 通过公式（3）（4）（5）可分别计算出各紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性隶属函数值U（Xj）、综合指标值F（Xj）和综合评价值D值，并通过D值为标准，对各品种紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性的强弱进行排序（表5），其中可汗、WL903 和精英的D值位列前三，表明它们具有较强的耐亚磷酸盐特性，WL712 的品种的D值最小，表明其耐亚磷酸盐的能力最差。

为综合评价不同紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性，采用最大距离法对D值进行聚类分析［41］，将37 个紫花苜蓿品种划分为4 类（图1）：第一类为WL712、威力、驯鹿、公农1 号、耐盐之星和阿尔冈金，属于亚磷酸盐敏感类型；第二类为皇冠、阿迪娜、巨能801、敖汉、保定苜蓿、龙牧801、WL343HQ、骑士 T、巨能Ⅱ、WL366HQ、WL656、莎莎、WL298HQ、维多利亚、三得利、牧歌和前景，属于弱耐亚磷酸盐类型；第三类为无棣、WL319HQ、苜丰、金皇后、WL232、惊喜、法多、旱地、WL363HQ、先行者、北极熊和精英，属于中度耐亚磷酸盐类型；第四类为WL903 和可汗，属于高度耐亚磷酸盐类型。

图1 37 个紫花苜蓿品种D 值聚类树状图Fig.1 The dendrogram of clusters for 37 alfalfa cultivars

2.3 紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性鉴定指标的筛选

为分析各指标与紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性之间的关系，筛选出有效的耐亚磷酸盐特性的鉴定指标，需建立可靠的耐亚磷酸盐特性评价的数学模型。为此，对12 个鉴定指标进行逐步回归分析，把耐亚磷酸盐特性的综合评价值（D值）作为因变量，各单项指标的耐亚磷酸盐系数作为自变量，建立最优回归方程：Y=−0.174+0.102PH+0.189DWR+0.168RL+0.187RSA−0.061Pn，（R2=0.9908，P=0.0001）。由方程可知，在12 个单项指标中，上述5 个指标对紫花苜蓿耐亚磷酸盐特性的筛选具有显著影响。对回归方程的估计精度进行评价（表6），结果显示各紫花苜蓿品种估计精度均在93.22%以上，说明方程中的指标对苜蓿耐亚磷酸盐特性影响显著，该方程可用于紫花苜蓿的耐亚磷酸盐特性评价。同时表明，在相同条件下测定其他品种的上述5 个指标并求得耐亚磷酸盐系数，继而通过该方程即可预测其他品种的耐亚磷酸盐特性。

2.4 耐亚磷酸盐类型品种间的特征比较

综合聚类分析及逐步回归分析结果，比较各鉴定指标在紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性类别中的表现特征，进一步探索导致紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性差异性的作用机理（表7）。

表6 回归方程的估计精度分析Table 6 Analysis of evaluation accuracy of equation

第一类（亚磷酸盐敏感型）：经过亚磷酸盐胁迫处理之后，紫花苜蓿幼苗的株高与第三类别相似，明显低于第二、四类别，根干重、总根长、根表面积等指标均明显低于其他类别，净光合速率与第二、三类别相同，明显高于第四类别。

第二类（弱耐亚磷酸盐类型）：经过亚磷酸盐胁迫处理之后，紫花苜蓿幼苗的株高高于第一、三类别，低于第四类别，根干重、总根长和根表面积明显高于第一类，低于三、四类别，净光合速率与第一、三类别相似，明显高于第四类别。

第三类（中度耐亚磷酸盐类型）：经过亚磷酸盐胁迫处理之后，紫花苜蓿幼苗的株高与第一类别相似，明显低于第二、四类别，根干重、总根长和根表面积均明显高于第一、二类别，低于第四类别，净光合速率与第一、二类别相似，明显高于第四类别。

第四类（高度耐亚磷酸盐类型）：经过亚磷酸盐胁迫处理之后，紫花苜蓿幼苗的株高明显高于第一、三类别。略高于第二类别，根干重、总根长和根表面积的数值均远高于前三类别，根干重可达到其他类别的1.23～1.89倍，总根长可达到其他类别的1.12～1.85 倍，根表面积可达到其他类别的1.16～2.19 倍，净光合速率最低，明显低于前三类别。

表7 聚类结果中各耐亚磷酸盐类别的表现特征Table 7 Description of each cluster in hierarchical cluster result

3 讨论

植物对亚磷酸盐的耐逆性表现为多重调控的复杂生理性状，在生长发育过程中植物外部形态及内部结构会发生变化以适应亚磷酸盐环境，使用单一性状不能准确地反映紫花苜蓿耐亚磷酸盐的特性［42］，本研究选择了37个苜蓿品种，对12 个形态和生理指标通过多元分析对不同品种耐亚磷酸盐的能力进行综合评价。同时，苗期是决定植物后期生长发育的关键时期，不同品种紫花苜蓿的耐亚磷酸盐特性在苗期已初步分化，在苗期鉴定品种不仅花费时间短而且可大批量选育［43］，为后期苜蓿种植提供支持。

通过将测定值转化为耐亚磷酸盐系数，排除了紫花苜蓿品种自身的差异性。对耐亚磷酸盐系数进行主成分分析，将所测定的12 个单项指标转化为5 个相互独立的综合指标，并且得到了不同紫花苜蓿品种幼苗的耐亚磷酸盐特性的综合评价值，相对公正地反映出各品种的耐亚磷酸盐的能力。建立的紫花苜蓿幼苗耐亚磷酸盐特性的评价回归模型表明在相同条件下，可通过测定上述5 个单项指标，并利用该评价模型来预测其他品种的耐亚磷酸盐的能力，使得紫花苜蓿耐亚磷酸盐能力的测定更加快捷方便，这为亚磷酸盐作为缓释磷肥提供了理论基础，同时也可以为亚磷酸盐为磷肥栽培苜蓿品种，培育及筛选耐亚磷酸盐的苜蓿品种提供依据。

与亚磷酸盐敏感型相比，高度耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种幼苗在亚磷酸盐胁迫下净光合速率较低，株高、根干重、总根长和根表面积则保持在较高水平，植物在缺磷时会长出侧根和增加根毛量可以进一步获得磷［44］。根的生长和根冠比的提高，是磷缺乏的标志［45］，在不利于亚磷酸盐转化为磷酸盐的环境中（例如水培、砂培）［46］，本试验紫花苜蓿为适应亚磷酸盐环境，根部的生长增强了获取磷的能力［45］。尽管植物容易吸收和转移亚磷酸盐，但它在植物中相对稳定，似乎不容易氧化或代谢［24］，同时亚磷酸盐通常比正磷酸盐更易溶解，与土壤成分的反应更少，这使得亚磷酸盐比正磷酸盐更容易被植物根部吸收［9］。在亚磷酸盐环境中，缺乏可供植物利用的正磷酸盐，参与正磷酸盐摄取的正磷酸盐转运蛋白或参与感知正磷酸盐状态的信号转导组件，不能有效区分正磷酸盐和亚磷酸盐阴离子［47−48］，使亚磷酸盐发挥正磷酸盐的信号作用，致使植物地上部感知自身不缺磷，所以根部磷含量增加，而地上部茎叶磷含量反而较正磷酸盐培养的苜蓿有所下降。紫花苜蓿的株高在亚磷酸盐的胁迫下受到抑制［45］，但高度耐亚磷酸盐的紫花苜蓿品种的株高与正磷酸盐处理相比差异不显著，高度耐亚磷酸盐品种由于根部生长较亚磷酸盐敏感型强，所以吸收的有效磷增加，同时促进根部生长及地上部植物生长，所以高度耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种株高较高。与正磷酸盐处理相比，在亚磷酸盐环境下的紫花苜蓿叶片较小，发育不良［49］，亚磷酸盐敏感型紫花苜蓿的株高、根干重、总根长和根表面积均处于最低，表明此类紫花苜蓿受到缺磷影响较大，植株生长受到抑制，生物量下降［50］。对亚磷酸盐有抗性的紫花苜蓿品种叶绿素含量稍有升高，保证了光合作用正常进行，有利于光合产物的积累，从而提高植物耐亚磷酸盐的能力。

因此，紫花苜蓿苗期耐亚磷酸盐的能力主要体现在苜蓿根部吸收正磷酸盐的能力和保证光合产物充分利用的能力。高度耐亚磷酸盐品种在亚磷酸盐条件下，仍能保持根系正常生长和光合作用正常进行，这些特征促使植株对正磷酸盐的吸收、光合产物充分利用是其强耐亚磷酸盐能力的重要原因。目前对亚磷酸盐的研究大多集中在农药、生长刺激剂等方面，关于植物耐亚磷酸盐品种的筛选报道较少。没有专门针对不同形态磷元素吸收方向的苜蓿育种，多数为对低浓度正磷酸盐磷肥耐受性的选育［51−53］。因此本试验通过探讨不同紫花苜蓿品种间的亚磷酸盐耐受性的差异具有一定的创新性，为今后研究苜蓿响应亚磷酸盐胁迫和高度耐受亚磷酸盐育种提供理论依据。在栽培方面，种植在正磷酸盐磷肥污染较严重或磷肥缺乏的地区，同时施用亚磷酸盐磷肥，不仅能解决磷肥污染和磷肥缺乏问题，也能保证苜蓿产量与质量。

4 结论

经过筛选，高度耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种有：WL903 和可汗；中度耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种有：无棣、WL319HQ 和苜丰等12 个品种；弱耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种有：皇冠、阿迪娜和巨能801 等17 个品种；亚磷酸盐敏感紫花苜蓿品种有：WL712、威力和驯鹿等6 个品种。

高度耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种幼苗对亚磷酸盐环境适应性较强，根部长度和根表面积的增加增强了植物吸收磷的能力；叶面积的减少和叶绿素的增加既降低了呼吸作用，又保证了光合的稳定进行。在相同亚磷酸盐条件下，通过测定紫花苜蓿幼苗的株高、根干重、总根长、根表面积和净光合速率等5 个指标，可快速鉴定和预测紫花苜蓿品种对亚磷酸盐耐性的强弱。本研究将为紫花苜蓿耐亚磷酸盐品种的筛选和推广提供一定依据，并为新型磷肥的开发提供一定参考。