响应面法优化藜麦秸秆饲料发酵工艺的研究

余肖飞 ，郭晓农 ，2，3*，张妍 ，刘子威 ，张喜闻 ，徐可新 ，吴治勇

（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3. 西北民族大学生物医学研究中心中国−马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030）

藜麦（Chenopodium quinoa）隶属藜科藜属，原产于南美洲安第斯山脉地区［1−2］。藜麦适应性强［3］，其秸秆含大量纤维素和木质素［4］，具有多种开发利用价值，逐渐成为植物饲料领域的研究热点。藜麦种植地区包括欧洲的英国、法国、意大利，非洲的马里和肯尼亚以及北美洲的美国和加拿大等国家和地区［5］。我国藜麦种植最早地区为西藏地区可追溯到20 世纪90 年代［6］。2019 年数据显示，中国藜麦种植面积和总产量已跃居世界第三，主要种植区域覆盖河西走廊、伊犁河谷、蒙古高原−乌兰察布、柴达木盆地、四川盆地和云贵高原等地区。其中甘肃省种植面积最广，达 3333 hm2。其次为内蒙古 2333 hm2、青海 1667 hm2、云南 1667 hm2、山西 1333 hm2、河北 1000 hm2［7］。我国对藜麦的研究仍处于育种、种植和初加工阶段，对其秸秆营养价值及应用的研究相对较少［8］，主要涉及多糖、黄酮、皂苷等化学成分［9−10］。侯召华等［11］研究表明，藜麦皂苷具备抗氧化、抗肿瘤、抑菌、免疫调节等药理活性，胡一晨等［12］研究表明，藜麦还富含维生素、必需氨基酸、矿物质（K、P、Mg、Ca、Zn、Fe）等养分。而其秸秆中亦含有有益于动物健康的天然抑菌成分。藜麦具有突出的饲用价值［13］。藜麦秸秆相对于其他作物秸秆含有较高的纤维素、木质素、蛋白质及脂肪等成分。而动物对纤维素和木质素的消化吸收利用的效率低。目前有关藜麦秸秆的开发应用研究较少，藜麦秸秆除了焚烧取暖之外，一般被弃置。本试验利用微生物发酵技术改善藜麦秸秆饲料品质，同时通过响应面法（response surface methodology，RSM）优化处理。试验选用产自甘肃省兰州市红古区的陇藜1 号，10 月刈割获取藜麦秸秆作为试验材料，试验采用乳酸菌、酿酒酵母两种微生物发酵藜麦秸秆，乳酸发酵可降低饲料pH 值，增加乳酸含量，降低丁酸含量，可抑制饲料中的致病菌和腐败菌生长，改善动物肠道功能［14］；酵母是兼性微生物，厌氧发酵能够获得酒精、甘油、酶等代谢产物，耗氧发酵可以获得酵母细胞或细胞组成成分［15］，在协同发酵［16］中可提供利于乳酸发酵的条件，开展不同微生物对藜麦秸秆饲料营养成分含量影响及差异分析，一方面变废为宝，合理利用作物秸秆，另一方面通过不同菌种的合理搭配，进行协同发酵，提高发酵效率甚至可改善其养分结构。在发酵过程中，添加酶制剂黑曲霉（Aspergillus niger），其可产生纤维素酶、α−半乳糖苷酶和淀粉酶，在有效降低藜麦秸秆中纤维素及木质素的同时，也提高了饲料中淀粉、脂肪等养分的含量。纤维素和木质素含量明显降低的发酵饲料对胃蛋白酶及胰蛋白酶的酶解抗性作用减弱，使藜麦秸秆更加蓬松柔软，适口性更好，而有利于动物主动采食，更有利于生物降解和动物消化吸收［17］。目前，种植藜麦的农户直接利用藜麦秸秆饲养绵羊等家畜，其饲用价值和经济效益没有得到很好的开发，本研究为藜麦秸秆的进一步开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用兰州市红古区种植的陇藜1 号藜麦秸秆，自然晾晒至表面枯黄，无霉变及腐败迹象；发酵剂选用酵母菌（安琪酵母股份有限公司，2018-11-25）、乳酸杆菌（成都臻植生物科技有限公司，2019-02-13）与黑曲霉（济宁玉园生物科技，2019-09-15）。

1.2 试验设计

试验始于2018 年5 月中旬，包括乳酸菌发酵、混合菌发酵以及黑曲霉对比发酵3 部分。乳酸菌发酵、混合菌发酵中均采用L（934）正交原理设计试验，设定发酵时间、含水量和菌剂添加量（混合比例）3 个因素，每个因素下设 3 个水平（表 1−2）。李凤玲等［18］研究表明，黑曲霉产酶丰富，可用于发酵饲料，其最佳发酵条件在70%含水量，25 ℃下培养42 h 以上，故在乳酸菌发酵的基础上做关于黑曲霉对藜麦秸秆饲料的简单对比试验，以试验组别4 作为空白对照，发酵时间为72 h，设计见表 3。

1.3 秸秆发酵

将藜麦秸秆经晾晒、风干后，利用秸秆粉碎机粉碎至粉末状，每试样取100 g。在无菌条件下按照试验要求调节水分与菌剂含量，充分搅拌混匀，装入密封袋内压实密封，置于24.5 ℃下发酵3～7 d 后，进行营养成分测定分析。

表1 乳酸菌发酵藜麦秸秆饲料正交试验因素水平Table 1 Levels of factors in orthogonal experiment of lactic acid bacteria fermenting quinoa straw feed

表2 混合菌发酵藜麦秸秆饲料正交试验因素水平Table 2 Factors of orthogonal experiment on fermentation of quinoa straw feed by mixed bacteria

表 3 1～19 组试验处理Table 3 Pilot group 1-19 test treatment

1.4 测定指标

1.4.1 粗蛋白（crude protein，CP）含量的测定 精确称取1.0 g 试样（凯氏定氮法），置于消化管中，加硫酸铜0.4 g，无水硫酸钾6.0 g，混合均匀，加入浓硫酸20 mL 与瓷片两小片，于电热炉上加热，待内容物全部炭化，至泡沫停止后，加强火力，至溶液呈透明的深蓝色，加热2 h，冷却后使用海能K9842 自动凯氏定氮仪（济南）进行测定。

1.4.2 粗脂肪（ether extract，EE）含量测定 精确称取3.0 g 试样（索氏抽提法），置于滤纸筒内，放入滤纸架，用磁铁吸住滤纸架。干燥恒重抽提杯，记录抽提杯质量，加入60 mL 石油醚。使用海能SOX406 脂肪测定仪（济南）进行抽提。将抽提杯取下，置于干燥箱内，烘干水分及剩余有机溶剂，移入干燥器中冷却后称量，计算脂肪含量。

1.4.3 粗纤维（crude fiber，CF）含量测定 精确称取2.0 g 试样（酸碱法），将样品放入已称量过的干燥过滤坩埚。使用海能F800 纤维测定仪（济南）测定。烘箱干燥后称重，计算粗纤维含量。

1.4.4 可溶性糖（soluble sugar，SS）含量测定 配制蔗糖标准溶液（紫外可见分光光度法），使用岛津UV-1800紫外分光光度计（上海）测定相对应的吸光度，绘制蔗糖标准曲线。精确称取1.0 g 试样，加入6～10 mL 蒸馏水，沸水浴30 min，3500 r·min−1离心10 min 取上清液，重提两次。定容至50 mL，用岛津UV-1800 紫外分光光度计测定吸光度。

1.5 数据分析

采用Excel 2010 整理数据绘图，采用Design-Expert V8.0.6 进行响应面作图，各项指标测定重复3 次。

2 结果与分析

2.1 感官品质测定

参照相关标准［19］制定适用于本试验的感官质量评定标准（表4）。

表4 感官质量评定标准Table 4 Criteria for sensory quality assessment

根据表4 感官质量评定标准对19 组（3 个平行）共计57 个样本进行测评（图1）。其中试验组1～9 为乳酸菌发酵，10～18 为混合菌剂发酵，19 为黑曲霉发酵。试验组10 评分最高，为8.2 分。而组3 有轻微霉味；组4 臭味较重；组6 有轻微臭味；组13 和19 出现发粘和轻微板结现象；黑曲霉发酵中也出现较重霉味，以上组别饲料感官品质均不理想（图1）。其余饲料则质地松软，有适宜的酸香味。随着含水量的升高和发酵时间的延长，会加大霉变的概率。当含水量为55%左右，发酵时间在3～5 d 时，饲料具有良好的感官品质。

图1 藜麦秸秆发酵饲料感官品质测评Fig.1 Sensory evaluation of fermented feed from quinoa straw

2.2 营养性指标三维响应曲面线

乳酸菌单独发酵藜麦秸秆粗纤维变化范围为20.7%～23.1%；乳酸菌与酵母菌混合制剂发酵下藜麦秸秆粗纤维变化范围为20.03%～20.71%。在相同含水量及发酵时间下混合发酵要比乳酸菌单菌降解纤维素作用更为明显。而两种不同的发酵剂作用下，纤维素最低含量出现在含水量为60%左右，发酵时间在72～100 h 的条件下，此时单菌发酵乳酸菌添加量为0.95 g左右，而混合发酵时混合比例为1.25，即非等比混合（图2）。

图2 藜麦秸秆饲料粗纤维三维响应面曲线Fig.2 Three-dimensional response surface curve of crude fiber of quinoa straw feed

未发酵的藜麦秸秆粗蛋白含量在10.14%～13.14%，单菌发酵后的藜麦秸秆粗蛋白含量在13.45%～15.26%，混合发酵粗蛋白变化范围为13.72%～15.03%，粗蛋白平均含量提高了约2.70%（图3）。从图中可以明显看出，含水量对粗蛋白含量有较大的制约，含水量过高或者过低都会使粗蛋白含量下降，最佳的含水量在58%左右。而在168 h 内粗蛋白含量与发酵时间呈正相关。

图3 藜麦秸秆饲料粗蛋白三维响应面曲线Fig.3 Three-dimensional response surface curve of feed crude protein of quinoa straw

粗脂肪含量在发酵过程中波动范围较小，未发酵的藜麦秸秆粗脂肪含量2.50%～2.60%，发酵后藜麦秸秆饲料粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%。无论单一菌剂发酵还是混合菌剂发酵，对藜麦秸秆饲料中粗脂肪含量的提高有轻微的促进作用（图4）。

图4 藜麦秸秆饲料粗脂肪三维响应面曲线Fig.4 Three-dimensional response surface curve of ether extract in quinoa straw feed

乳酸菌发酵藜麦秸秆可溶性糖含量在21.54%～24.10%，混合菌发酵后的可溶性糖含量变化范围为24.50%～27.10%，混合制剂对可溶性糖含量的提高要优于单一菌剂，平均提高了3%左右，可溶性糖含量的变化随发酵时间的延长呈现先下降后升高的趋势，峰值出现在发酵末期。出现这种情况的原因可能为发酵初期乳酸菌与酵母菌的新陈代谢会消耗部分糖分作为能源物质（图5）。

图5 藜麦秸秆饲料可溶性糖三维响应面曲线Fig.5 Three-dimensional response surface curve of soluble sugar in quinoa straw feed

2.3 黑曲霉对藜麦秸秆发酵饲料品质的影响

黑曲霉有助于降解纤维素与可溶性糖含量的提高，藜麦秸秆经黑曲霉发酵后粗纤维含量降低了1.88%，粗脂肪下降了0.02%，粗蛋白含量减少了0.04%，可溶性糖含量上升了1.30%（图6）。图中标出标准误差线。黑曲霉发酵中营养指标含量分别为CF（20.47±1.41）%，EE（2.49±0.01）%，CP（13.80±1.16）%，SS（24.80±1.42）%；空白对照（乳酸发酵）组中营养指标含量分别为CF（22.35±1.52）%，EE（2.51±0.03）%，CP（14.20±1.56）%，SS（23.50±1.12）%；但在感官品质上，黑曲霉发酵的藜麦秸秆饲料与对照组的藜麦秸秆发酵饲料的感官品质均不佳，具有较浓的霉味与恶臭味。

图6 黑曲霉发酵对各营养指标的影响Fig. 6 The effect of Aspergillus Niger fermentation on the nu⁃tritional indexes

3 讨论

粗纤维是饲料中质地坚硬粗糙、适口性差、且牲畜饲用后不易消化的部分，它遍及植物茎叶和秕壳之中［20］。粗纤维中不仅富含纤维素，还包括一些半纤维素与木质素等，木质素是完全不被家畜消化的物质。粗纤维虽然消化利用率及营养价值低，但在家畜日粮中是不可缺少的成分。因为它体积大［21］，对家畜胃肠容积有一定扩充作用，家畜食后有饱腹感［22］，对家畜育肥有利。粗纤维有刺激胃肠蠕动的机械作用，有利于消化和排粪正常［23］。若饲料中含粗纤维量过多，不仅影响饲料品质，而且家畜不能直接利用粗纤维中的能量，进而影响家畜健康和畜产品品质。藜麦秸秆作为优质饲料的原料之一，其粗纤维含量低于玉米（Zea mays）秸秆，麦秸等，经乳酸菌、酵母菌发酵后粗纤维含量明显降低。试验结果表明乳酸发酵中纤维素最低含量为20.7%，波动范围为2.40%；混合发酵纤维素含量最低为20.03%，波动范围为0.68%；可见乳酸菌与酵母菌协同发酵处理藜麦秸秆中粗纤维含量明显优于单菌发酵，而且混合发酵波动范围小，纤维素降解效果更稳定。同时混合发酵组中最优发酵群出现在混合比例1.25（非等比混合）处，前期酵母发酵占主导地位为乳酸发酵创造有利条件，后期进行协同发酵，这也体现出混合发酵的优势。酵母菌的添加为乳酸菌提供了良好的厌氧环境，保障了发酵过程中乳酸菌的新陈代谢。

粗蛋白质包含真蛋白质和非蛋白质含氮物（non-protein nitrogen，NPN）两部分［24］，是家畜生长、发育、繁殖及生命活动所必需的基础养分。在家畜饲养中，蛋白质应保障供给，特别是处在生长期的幼畜和产奶母畜。黄开武［25］研究表明，家畜日粮中如果粗蛋白质含量缺乏，会使家畜的健康、生长、发育、繁殖、生产水平及畜产品品质受到不同程度的影响。严重时，还会使家畜发生贫血、瘦弱、抗逆能力减退，乃至发病、死亡。基于这种状况，在家畜饲养过程中必须使日粮粗蛋白质的含量达到一定的水平并保持。本试验乳酸菌发酵中粗蛋白含量为13.45%～15.26%，变化范围为1.81%，混合发酵中粗蛋白含量为13.72%～15.03%，变化范围为1.31%。虽然乳酸发酵中粗蛋白含量出现了最高水平，但相比之下混合发酵波动范围小，效果稳定，结果更具代表性，且混合发酵最低粗蛋白含量高出乳酸发酵0.27%，这也表明混合发酵对粗蛋白的保留能力强。出现混合发酵峰值低于乳酸发酵的可能原因有：1）混合发酵中酵母菌的新陈代谢会消耗部分蛋白质；2）酵母菌的厌氧反应不产蛋白及相关酶类。此外各种饲料蛋白质含量及品质差异较大［26］，而藜麦秸秆作为植物性秸秆饲料在蛋白质含量和品质上明显劣于动物性饲料，也不及油饼类饲料、豆科植物及禾本科植物，故在后续实际生产中需补充其他蛋白质饲料。

粗脂肪包括真脂和类脂（如固醇、磷脂等）。脂肪在家畜饲养中用以维持体温与供给体内各器官运动时所需要的能量，同时也是脂溶性维生素的携带者，若日粮中脂肪缺乏则影响这一类维生素的吸收和利用，容易导致家畜的脂溶性维生素缺乏症。而日粮中脂肪酸的不足会妨碍家畜生长或引起死亡。饲料中添加适量的脂肪不仅能够改善适口性，还能产生“额外的热能效应”的有益作用。饲料中粗脂肪含量逾越5%，容易引起腹泻或过肥，对于反刍畜还会抑制瘤胃微生物的繁殖，从而降低其消化功能［27］。本试验乳酸发酵中粗脂肪峰值为2.67%，混合发酵中峰值为2.91%，经发酵后粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%，首先藜麦秸秆作为植物性秸秆饲料，其含脂量是非常低的，但经微生物发酵后其脂含量小幅提高，出现这种结果与本试验所选用的酵母菌种具产脂作用有必然的关系。

可溶性糖作为贮存在植物体组织中的营养物质，也是家畜所必需的养分。可溶性糖含量高低可衡量某一植物性饲料的实际应用价值，除提供家畜所需主要的能量外，也参与维持体内细胞渗透压平衡。本试验研究结果显示乳酸菌发酵可溶性糖含量在21.54%～24.10%，峰值为24.10%；混合发酵可溶性糖含量为24.50%～27.10%，峰值为27.10%，相比之下混合发酵提高可溶性糖含量的作用更显著。在发酵过程中，乳酸对糖的理论转化率为50%［28］，乳酸菌和酵母菌虽消耗部分可溶性糖以供自身正常生理代谢，发酵后可溶性糖含量提高是罕见的，以后可做进一步探究。

此外，试验过程中发现乳酸菌发酵藜麦秸秆饲料受含水量影响极为明显，在含水量为65%以上时，极易受到杂菌感染，饲料颜色发黑且有霉味，原因可能是在含水量过高时，会影响乳酸菌糖化效果，导致发酵饲料温度提升快而高，不利于乳酸菌生长，导致优势菌种群发生变化，而协同发酵有利于对这种局面的调控。以后的试验进程中可对菌株的选择、搭配与使用做更细致的考虑。我国于2014 年才开始大面积种植藜麦，但是对于藜麦收获后的副产品藜麦秸秆的利用率却极低，研究表明藜麦有较高的开发利用价值，藜麦秸秆作为发酵饲料的利用也许是未来发展藜麦副产品生产的一个关键点。

4 结论

藜麦秸秆相对于玉米、小麦（Triticum aestivuml）秸秆，其具有蛋白含量高、粗纤维含量低，更接近于家畜日粮需要量的优点。藜麦秸秆生物量积累和品质表现均表明，藜麦秸秆是一种很有潜力的饲草原料。发酵后：1）混合发酵降解纤维素效果明显，发酵后最低纤维素含量为20.03%；2）藜麦秸秆饲料较未发酵的藜麦秸秆粗蛋白平均含量提高了约2.70%；3）粗脂肪含量提升0.24%～0.31%；4）发酵后藜麦秸秆饲料平均可溶性糖含量提高了约3%。最佳发酵组为含水量为55%～60%，发酵时间为（120±10）h，混合比例为1～1.25。本试验通过微生物发酵改善了藜麦秸秆的营养成分，达到了可饲用标准；同时也使藜麦秸秆饲料的品质得以提高。结果表明适当乳酸菌发酵藜麦秸秆增加了其粗蛋白与可溶性糖含量，这与乳酸菌能够提高原料中蛋白的消化利用率的作用相符［29］，同时降解粗纤维作用明显。协同发酵对发酵过程中霉变也起到一定的抑制作用。本研究为后续藜麦秸秆发酵饲料的进一步开发利用奠定了一定的基础。