宫颈癌细胞外泌体hsa_circ_0087432对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

夏红，杨翔，陈烨，李虎，褚桂芬

广州市番禺区中心医院妇科，广州 511040

宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中居第二位，严重危害女性健康[1]。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的内源性RNA分子，转录后具有调控基因表达的作用[2-4]。circRNA在人体细胞中广泛稳定表达[5]，且在疾病发展过程中呈特异性表达，因此可成为肿瘤早期诊断与预后评估的标志物[6]。外泌体(exososme，EXs)是细胞内起源的纳米级细胞外脂质双层囊泡，其内携带有多种活性物质，如circRNA、miRNA、mRNA及特异性的蛋白质，具有广泛的生物学活性[7-8]。此外，大量研究表明，外泌体作为信号分子载体，可参与细胞间信息传递，并与肿瘤的转移密切相关[9-10]。有研究表明，外泌体中含有比分泌细胞更多的circRNA，且这一分泌可被miRNA调控[11-12]。因此，外泌体中circRNA的多样性和特异性使其能够用于肿瘤的辅助诊断，也可用于监控肿瘤的进展，近年来备受关注。本研究探讨了hsa_circ_0087432在宫颈鳞状细胞癌发生发展中的作用，提出hsa_circ_0087432可能是通过癌细胞分泌的外泌体促进宫颈鳞癌侵袭与转移的假设，以此来探讨外泌体中的circRNA对宫颈鳞癌诊疗的意义。

1 材料与方法

1.1 实验标本及材料 收集广州市番禺区中心医院2019年6月－2020年6月诊断为宫颈鳞癌且术前未行放化疗的30例患者的宫颈癌组织及血清作为实验组，30例未患宫颈癌的女性正常宫颈组织及血清作为对照组。本研究经过番禺区中心医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。Siha细胞(人宫颈鳞癌细胞)、人脐静脉内皮细胞购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司。胎牛血清、0.25%EDTA胰蛋白酶溶液、青链霉素、DMEM培养基、PBS均购自美国Gibco公司；MEM培养基购自美国Hyclone公司；Lipofectamine 3000试剂、Western blotting相关试剂及BCA蛋白定量试剂盒、荧光定量PCR仪(ABI 7500)购自美国ThermoFisher公司；CD9、CD63和CD81抗体购自美国Abcam公司；实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购自广州瑞真生物技术有限公司；4%多聚甲醛购自武汉赛维尔生物科技有限公司；外泌体RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；细胞外泌体提取试剂购自广州市锐博生物科技有限公司；PKH-26染料购自美国Sigma公司；hsa_circ_0087432过表达质粒载体hsa_circ_0087432-pLC5-ciR和其空载体pLC5-ciR购自广州吉赛生物科技股份有限公司；GAPDH、hsa_circ_0087432引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2 方法1.2.1 细胞培养及质粒转染 人脐静脉内皮细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM高糖完全培养基培养，宫颈癌细胞株(Siha)用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的MEM完全培养基培养，置入37 ℃、5% CO2培养箱中，每2 d换液1次，待细胞密度达90%时进行传代培养或质粒转染。Siha细胞按不同处理分为3组：control组(未转染质粒)，vector组(转染pLC5-ciR)和hsa_circ_0087432组(转染hsa_circ_0087432-pLC5-ciR)，转染流程按照说明书进行操作。转染24～48 h，荧光显微镜观察转染效率，拍照。qPCR验证转染后hsa_circ_0087432的表达。

1.2.2 外泌体分离、鉴定及内皮细胞对其摄取的检测 细胞转染成功后，弃去培养基，PBS洗3次，更换为10%无外泌体血清的完全培养基，24 h后收集细胞上清，以备后续提取外泌体。参照外泌体提取试剂说明书提取外泌体，适量PBS重悬外泌体，取10 μl采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，其余置入–80 ℃冰箱保存。采用透射电子显微镜鉴定外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)技术测定外泌体粒径范围。Western blotting检测外泌体生物标志物CD9、CD63及CD81的表达情况。提取外泌体总蛋白，以每孔20 μg上样电泳，完成后将蛋白转移至0.45 μm PVDF膜上，封闭后加入一抗，置于4 ℃冰箱孵育过夜。第2天孵育二抗1 h，TBST洗膜3次后，加显影液曝光蛋白条带，统计分析灰度值。

参照PKH26染料说明书按比例标记外泌体，提纯再次重悬后，加入培养基中与内皮细胞避光共培养24 h，PBS洗3次；4%多聚甲醛溶液固定后，PBS洗3次；DAPI染色5～10 min，PBS洗3次；抗荧光淬灭封片剂封片后，荧光显微镜下拍照。

1.2.3 血清外泌体RNA的提取 血清按收集的来源不同分为宫颈癌组与对照组。提取方法参照血清外泌体RNA提取试剂盒说明书，完成后用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，最后采用SYBR®Green法进行实时定量PCR检测。

1.2.4 宫颈组织RNA的提取 宫颈组织按收集的来源不同分为宫颈癌组与对照组。采用Trizol法提取组织中的总RNA，称取组织，每10 mg组织加入1 ml Trizol试剂，加入研磨钢珠后放在研磨机内研磨，全程冰上操作。然后参照细胞总RNA提取操作步骤，得到总RNA，测定浓度后，根据试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，最后采用SYBR®Green法进行实时定量PCR。

1.2.5 qPCR检测 采用SYBR®Green法，操作步骤按照试剂盒说明，配制总反应体积为20 μl的反应体系，以GAPDH为内参。引物序列(5'-3')如下：GAPDH正义AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反义GCAGG AGGCATTGCTGATGAT；hsa_circ_0087432正义CG CATTATGCCTGATTCCAA，反义CTGCTGGACTAG GGTGAAAA；hsa_circ_0081672正义TTTACCAACG CCATCACCGA，反义CCCAGTGTGTGGTCTTCTT TGT；hsa_circ_0075430正义CAGCACACGGCGGA AGAAA，反义CCCCTGATTGTGACCTTCGT。qPCR结果采用2–ΔΔCt方法进行计算。

1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖情况 人脐静脉内皮细胞提前1 d接种于96孔板上，按不同处理分为3组：control-Exs组(siha细胞外泌体)、hsa_circ_0087432-Exs组(hsa_circ_0087432组siha细胞外泌体)、vector-Exs组(vector组siha细胞外泌体)，每组6个复孔，细胞数3×103个/孔。细胞贴壁后，按照分组加入外泌体干预48 h，更换含有CCK-8工作液的培养基(CCK-8工作液与培养基配制比例为1:10)，每孔100 μl，37 ℃避光孵育1.5～2.0 h，用酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移情况 分组同1.2.6。提前1 d接种人脐静脉内皮细胞于6孔板上，每孔保持等量的细胞悬液，待细胞生长至对数期，融合至90%时，取200 μl无菌枪头，在6孔板上划线，PBS洗去细胞碎片，更换含1%血清的完全培养基，同时加入外泌体，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。划痕后0、12、24 h后分别对划痕处进行拍照。实验重复3次。

1.2.8 Transwell小室检测细胞迁移能力 分组同1.2.6。细胞同步化12 h后，胰酶消化，计数细胞，小室内加入200 μl细胞悬液及外泌体，培养液为含0.5%血清的完全培养基，下室加入400 μl含20%血清的完全培养基。常规培养24～48 h，用棉签擦去内室的细胞，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，显微镜下计数小室底部滤膜下层穿过的细胞数，每组计数5个视野。实验重复3次。1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，hsa_circ_0087432在宫颈癌和正常组织及血清外泌体中的表达差异采用两独立样本t检验进行分析；符合方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组宫颈组织和血清外泌体中hsa_circ_0087432的表达水平比较 qPCR结果显示，实验组患者宫颈组织中hsa_circ_0087432表达量(4.03±1.51)明显高于对照组(1.00±0.26，P＜0.01)；两组hsa_circ_0081672及hsa_circ_0075430的表达量差异无统计学意义(P＞0.05，图1A)。此外，实验组血清外泌体中hsa_circ_0087432的表达量(1.97±0.04)明显高于对照组(1.02±0.23)，差异有统计学意义(P＜0.01，图1B)。

2.2 外泌体形态、特征蛋白鉴定及细胞摄取 分别收集control组、vector组及hsa_circ_0087432组Siha细胞的上清提取外泌体。电镜下观察发现Siha细胞的胞外囊泡大部分呈椭圆形或圆形(图2A)，粒径分析显示上清中提取的囊泡颗粒直径大小分布在30～150 nm(图2B)，Western blotting结果显示control组及hsa_circ_0087432组囊泡中的CD9、CD81及CD63表达均呈阳性(图2C)，表明提取的细胞外囊泡为外泌体。PKH-26标记的外泌体与人脐静脉内皮细胞共培养，免疫荧光染色后发现，外泌体进入细胞内部，在细胞核周围分布，说明外泌体可以很好地被细胞摄取(图2D)。

2.3 过表达hsa_circ_0087432的外泌体对人脐静脉内皮细胞增殖的影响 qPCR结果显示，与vector-Exs组(2.29±0.21)相比，hsa_circ_0087432-Exs组hsa_circ_0087432表达量(11.39±1.71)明显升高(P＜0.001)，提示成功转染。CCK-8检测结果显示，hsa_circ_0087432-Exs组细胞活力(1.57±0.04)明显高于control-Exs组(1.09±0.11)及vector-Exs组(1.27±0.02)，差异有统计学意义(P＜0.001，P＜0.05)。

图1 实验组与对照组宫颈组织(A)及血清外泌体(B)中hsa_circ_0087432的表达水平Fig.1 The expression level of hsa_circ_0087432 in cervical tissue (A) and serum exosomes (B) in experimental group and control group

图2 外泌体电镜图、粒径分析、特征蛋白的鉴定及细胞内摄取Fig.2 Exosomes, particle size, identification of characteristic proteins and intracellular uptake

2.4 过表达hsa_circ_0087432的外泌体对人脐静脉内皮细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，干预12 h后，hsa_circ_0087432-Exs组的迁移面积占比(24.66%±2.92%)高于control-Exs组(15.01%±3.12%)及vector-Exs组(18.07%±4.34%)；干预24 h后，hsa_circ_0087432-Exs组的迁移面积占比(74.84%±13.22%)明显高于control-Exs组(38.70%±2.12%)及vector-Exs组(35.02%±4.43%，P＜0.05或P＜0.01，图3A、C)。Transwell检测结果显示，与vector-Exs组[(1218.00±103.53)个]及control-Exs组[(1044.00±103.79)个]比较，hsa_circ_0087432-Exs组迁移细胞数量[(1755.00±97.35)个]明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05，图3B、D)。

图3 过表达hsa_circ_0087432后细胞分泌的外泌体对人脐静脉内皮细胞迁移的影响Fig.3 Exocrine derived from the cells which over-pressing the hsa_circ_0087432 can promote the proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells

3 讨 论

circRNA是一种内源性RNA，可作为miRNA海绵或竞争性内源性RNA参与各种疾病的发生发展[13]。Zhang等[14]发现，hsa_circ_0000069可通过海绵作用吸附miR-873-5p，进而调节靶基因TUSC3的表达，参与宫颈癌的增殖、侵袭和转移。Ma等[15]也发现hsa_circ_0005576可与miR-153相互作用，上调KIF20A的表达，以此促进宫颈癌的进展。目前，circRNA已被证实在肿瘤组织及细胞中呈异常表达，极可能参与肿瘤的发生发展[12]。另外，circRNA还可通过调控Wnt信号通路、上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)[16]等影响肿瘤的发生发展、侵袭转移及耐药性。Wang等[17]研究发现，circRNA_PVT1可通过靶向miR-1286诱导宫颈癌细胞的EMT，促进宫颈癌的迁移侵袭。朱小青和罗枫[18]在GEO数据库中筛选出宫颈鳞状细胞癌组织与正常宫颈组织中119种差异表达的circRNA，分析发现宫颈鳞状细胞癌的发生、发展可能与hsa_circ_0031027/hsa-miR-132-3p/KLHL11及hsa_circ_0075341/hsa-miR-4747-5p/LY6G6C两条调控途径有关。Jiao等[19]发现，上调E-cadherin可降低hsa_circ_0000745的表达水平，从而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

外泌体内含有大量生物活性物质，如circRNA、miRNA、mRNA及蛋白质等，可作为细胞间信息交流传递的载体。有学者研究发现，肿瘤外泌体与肿瘤的侵袭和转移密切相关，这提示其有望成为临床诊疗的指标[20-21]。Zhou等[22]发现，循环外泌体中的miR-221-3p可下调VASH1的表达，促进淋巴、血管发生，与宫颈鳞状细胞癌患者的癌区淋巴管密度及淋巴结转移数目有关。还有学者通过对血浆外泌体miRNA测序及组织PCR进行研究发现，宫颈癌患者血浆外泌体中let-7d-3p、miR-30d-5p与健康人的表达存在差异，可作为诊断生物标志物用于宫颈癌及其前体的非侵入性筛查指标[23]。崔虎军等[24]发现外泌体miRNA29在宫颈癌转移中有重要作用。

本研究通过qPCR法证实了hsa_circ_0087432在宫颈癌患者癌组织与正常组织中的表达存在差异，且在患者与健康人血清外泌体中的表达也存在差异，提示hsa_circ_0087432可能是通过癌细胞分泌至外泌体，并参与肿瘤的侵袭转移。根据这一结果，本研究通过质粒转染Siha细胞，过表达了细胞中的hsa_circ_0087432，收集其细胞上清后提取外泌体，并在内皮细胞中进行了验证。CCK-8检测结果证实，来源于过表达hsa_circ_0087432的细胞的外泌体可更明显地提高内皮细胞的增殖能力。划痕实验及Transwell迁移实验也证实，过表达hsa_circ_0087432后提取的外泌体可更好地促进内皮细胞的迁移。以上结果均提示宫颈癌患者外泌体中的hsa_circ_0087432参与了宫颈癌的侵袭及转移。

综上所述，本研究结果显示，hsa_circ_0087432在宫颈癌患者组织和血清中高表达，且有可能通过外泌体的方式促进宫颈癌细胞的转移，为以后的研究提供了新的线索和思路。但以上数据仅表明hsa_circ_0087432参与了宫颈癌的发展进程，并未深入探讨其对宫颈癌侵袭、转移等的具体机制，后续将进一步进行深入研究。