人参皂苷Rg1对大鼠阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征引起的肺损伤及Nrf2/HO-1信号通路的影响

田婵婵，王宏志，马欣悦

0 引言

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是世界上最普遍的慢性呼吸系统疾病[1]。OSAHS会导致短暂的呼吸停止(呼吸暂停)或睡眠期间流量明显减少(呼吸不足)[2]，其中男性的发病率为22%(9%～37%)，女性的发病率为17%(4%～50%)[3]。慢性间歇性低氧(Chronic intermittent hypoxia,CIH)是OSAHS的主要病理特征，表现为睡眠中反复出现缺氧和复氧情况，是OSAHS导致心脑血管并发症的主要因素[4]。OSAHS引起组织损伤，特别是在肺组织中，CIH可能引起肺部炎症，导致肺纤维化[5]。

研究发现，Nrf-2是人体抵抗氧化应激的重要调节剂，可以预防多种氧化应激疾病，例如癌症、高血压、肺纤维化、肾纤维化、阿尔茨海默病[6-7]。作为血红素加氧酶家族的成员，HO-1在抗炎、抗氧化和凋亡抑制中起着至关重要的作用[8]。因此，Nrf2/HO-1信号通路已成为氧化应激反应的重要信号途径[9]。

人参皂苷Rg1(GRg1)是一种四环三萜类化合物，是从人参提取的生物活性成分之一。多项研究表明，GRg1具有抗氧化活性[10]，可有效减轻心脏、肝脏等的纤维化[11-12]，还可抑制IL-6和TNF-α的表达，减轻内质网应激和炎症反应[13-14]。

本实验通过建立CIH大鼠模型，研究人参皂苷Rg1对大鼠OSAHS引起的肺损伤及Nrf2/HO-1信号通路的影响，进一步探讨其作用机制，为临床治疗OSAHS提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SD大鼠(雄性，SPF级，6周，体重180～220 g)购自三峡大学实验动物中心。实验大鼠饲养于标准动物房中，正常饮食饮水，实验动物设计经过我院伦理委员会审查。大鼠适应环境2周后进行实验。

1.1.2 试剂 人参皂苷Rg1(HPLC≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司。大鼠MDA试剂盒、大鼠SOD试剂盒、大鼠GSH试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。大鼠TNF-α试剂盒、大鼠IL-1β试剂盒、大鼠IL-6试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。HE试剂盒购自北京开瑞基生物科技有限公司。TRIzol试剂、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和SYBR®Premix EX TaqTMII试剂盒购自日本TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Abcam公司。兔抗COX-2抗体，兔抗iNOS抗体，兔抗HO-1抗体、兔抗Nrf2抗体、兔抗GAPDH抗体和山羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CIH模型制备 造模：建立与OSAHS的病理生理特征相似的CIH动物模型。低氧舱内先输入压缩空气30 s，后输入氮气30 s，进行循环。实验过程中注意检测低氧舱内的氧浓度，使舱内氧浓度控制在8%～21%。实验过程中舱内产生的二氧化碳和水蒸气被生石灰和硅胶吸取[15]。大鼠每天定时在低氧舱内8 h，共4周。实验结束后进行CIH模型鉴定。

1.2.2 分组及给药 ①分组：60只SD大鼠分为4组：对照组(control组)、慢性间歇性缺氧组(CIH组)、人参皂苷Rg1低剂量组(CIH+GRg1-L组)和人参皂苷Rg1高剂量组(CIH+GRg1-H组)，每组15只，control组大鼠不予任何处理，CIH组、CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组按“1.2.1”进行模型制备。②给药：给药方式为灌胃，control组：无菌生理盐水，4 ml/kg；CIH组：无菌生理盐水，4 ml/kg；CIH+GRg1-L组：18 mg/kg的GRg1，给药体积为4 ml/kg；CIH+GRg1-H组：36 mg/kg的GRg1，给药体积为4 ml/kg[16]。于造模前经灌胃相应剂量的生理盐水或GRg1。每天给药1次，连续7 d。

1.2.3 肺功能测定 在末次给药2 h后，采用动物肺功能分析系统测定各组大鼠的肺功能，计算IC、PEF、FEV0.3和VE。

1.2.4 MDA、SOD、GSH、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量或活性测定 将各组大鼠肺组织放入到9倍体积的PBS中，用匀浆器分散到匀浆中，冻融3次，并在4 ℃以3 000 r/min 离心15 min，收集上清液。使用试剂盒分别检测MDA、GSH、TNF-α、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及IL-1β、SOD的活性。

1.2.5 HE染色 各组大鼠的肺组织在室温下用4%多聚甲醛固定过夜，用水洗涤6 h，然后在梯度浓度的乙醇中脱水(70%，2 h；80%，过夜；90%，2 h；100%，1 h)。将组织浸入二甲苯中直至透明，然后在60 ℃的石蜡中包埋2 h。将组织块切成5 μm薄片，在水中摊开并转移到载玻片上，于60 ℃干燥24 h。将切片在二甲苯中脱蜡，以梯度浓度的乙醇(100%，5 min；95%，2 min；85%，2 min；75%，2 min)中脱水。然后将切片用苏木精染色5 min，冲洗后再用伊红染色3 min，在梯度浓度的乙醇中脱水(每次2 min，分别以75%、85%、95%的比例脱水；每次5 min，以100%的比例脱水)，在二甲苯中透明2次，每次10 min。之后使用中性树胶封片，使用光学显微镜观察切片并拍照。

1.2.6 qRT-PCR检测 TRIzol试剂提取肺组织中的总RNA。使用紫外分光光度计检测总RNA的含量，并将每个配对的样品调节至相同浓度。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。按照SYBR Premix EX TaqTMII试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 30 s(1循环)95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40循环)。

使用StepOnePlus仪器完成实验后，采用2-△△Ct法分析数据。引物见表1。

1.2.7 Western blot检测 使用全细胞裂解分析试剂盒从组织中提取总蛋白，并使用Nucleus Protein Extraction Kit从细胞核中提取蛋白。使用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度后，通过SDS-PAGE分离总蛋白质和细胞核蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶封闭1 h后，将PVDF膜与以下抗体在4 ℃孵育过夜：兔抗COX-2(1∶400)、兔抗iNOS(1∶400)、兔抗Nrf2(1∶400)、兔抗HO-1(1∶400)和兔抗GAPDH(1∶1 000)。随后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，持续5 min，并与山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗涤3次，持续5 min。最后显影曝光，用Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

表1 引物序列

2 结果

2.1 CIH模型的鉴定 大鼠在低氧舱内的最后1 d，分别在低氧舱内氧最低浓度和低氧舱内氧最高浓度时，随机对大鼠进行血氧饱和度和动脉血气分析检测，其血氧饱和度为70%～92%，动脉氧分压为60.7～80.1 mmHg，接近OSAHS病理生理特点，因此CIH动物模型建立成功。

2.2 各组大鼠肺功能的比较 与control组比较，CIH组大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均明显降低(P<0.01)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均升高(P<0.01)。结果见表2。

2.3 各组大鼠肺组织中MDA、SOD和GSH的表达变化 与control组比较，CIH组大鼠肺组织中MDA的含量明显增加(P<0.01)，SOD的活性和GSH的含量均明显降低(P<0.001，P<0.01)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中MDA的含量均降低(P<0.05)，SOD的活性和GSH的含量均升高(P<0.05)。结果见表3。

表2 各组大鼠的IC、PEF、FEV0.3、VE比较

表3 各组大鼠肺组织中MDA、GSH含量以及SOD活性比较

2.4 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化 与control组比较，CIH组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均显著增加(P<0.01)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均降低(P<0.05)。结果见表4。

2.5 各组大鼠肺组织的病理变化 control组大鼠肺组织肺泡结构正常，没有炎性细胞浸润；CIH组大鼠肺组织严重受损，肺泡结构变形，上皮细胞变性，坏死脱落，并出现间质水肿，肺泡中可见炎性细胞浸润，大量液体渗出；CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织受损减轻，炎性细胞浸润减少，肺部水肿也减轻。结果见图1。

表4 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较

2.6 各组大鼠肺组织中COX-2和iNOS的表达变化 与control组比较，CIH组大鼠肺组织中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表达水平均显著上调(P<0.001)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表达水平均下调(P<0.05)；由图2B可知，与control组比较，CIH组大鼠肺组织中COX-2 蛋白和iNOS 蛋白表达水平均显著上调(P<0.001)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中COX-2蛋白和iNOS蛋白表达水平均下调(P<0.05)。见图2。

图1 各组大鼠肺组织的病理变化

图2 各组大鼠肺组织中COX-2和iNOS的表达变化

2.7 各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达变化 与control组比较，CIH组大鼠肺组织中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平均显著上调(P<0.001)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表达水平均下调(P<0.05)；由图3B可知，与control组比较，CIH组大鼠肺组织中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表达水平均显著上调(P<0.001)；与CIH组比较，CIH+GRg1-L组和CIH+GRg1-H组大鼠肺组织中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表达水平均下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图3。

图3 各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达变化

3 讨论

OSAHS是睡眠呼吸障碍的一种常见情况，其患病率在中老年人中为5%～14%[17]。OSAHS的病理生理学包括睡眠期间反复出现的部分或完全的上呼吸道阻塞，导致通气不足、呼吸暂停、间歇性缺氧和高碳酸血症[18]。OSAHS导致呼吸作用增加，交感兴奋性增加，睡眠结构改变和缺氧，这可能导致肺、心血管和脑血管事件，并引起代谢紊乱、神经认知功能障碍和其他疾病[19-20]。本研究采用低氧舱建立CIH模型大鼠，结果发现，大鼠的肺功能明显下降。

研究发现，ROS可以损伤细胞膜，被认为是氧化应激的标志[21]。MDA是由ROS催化的脂质氧化的最终产物，可攻击细胞膜和电子传输链[22]。因此，本研究将MDA的水平作为氧化应激反应的生物标志物进行了检测。SOD是一种重要的抗氧化酶，与催化酶和过氧化物酶一起可消除ROS[23]。GSH是一种三肽，在由谷胱甘肽过氧化物酶催化的反应中，被ROS氧化为谷胱甘肽二硫化物。然后，谷胱甘肽还原酶将谷胱甘肽二硫化物还原为GSH，以消除ROS[24]。本研究证明，CIH能引起氧化应激反应，使MDA含量升高，SOD活性和GSH含量降低。在本研究中，肺组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6表达增加。TNF-α、IL-1β和IL-6均由白细胞产生，并在炎症反应中起重要作用[25-26]。这些结果的增加表明肺组织中存在炎症。

此外，CIH激活了缺氧诱导因子α，该因子刺激各种基因的转录，包括COX-2和iNOS[27]。在氧化应激过程中，iNOS的表达迅速增加。iNOS表达受多种细胞因子诱导，包括干扰素γ、IL-1、IL-6和TNF-α[28]。COX是前列腺素合成中的关键酶，而COX-2是可诱导的异构体，具有抗炎和抗氧化的特性[29]。本研究发现，CIH组大鼠肺组织中COX-2和iNOS蛋白明显增加，与上述文献报道一致。

Nrf2是抗氧化的最重要调节剂。在常氧条件下，Nrf2通常在细胞质中，但在氧化应激的条件下，Nrf2转移到细胞核中，激活抗氧化反应元件，并促进下游基因的转录，包括GPx、SOD和HO-1[9]。HO-1是一种可诱导的酶，可被多种压力诱导。Nfr 2/HO-1信号通路是氧化应激反应的重要信号途径，参与抗炎、抗氧化等[30]。本研究发现，CIH组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1蛋白表达上调。

人参是一种传统中药，可能会影响许多生物过程，包括炎症反应，细胞增殖和凋亡。GRg1是人参中含量最丰富的成分，是人参药理作用的关键成分。有报道，GRg1对活性氧应激、衰老、血管生成和神经元分化具有调节作用[31]。本研究中，GRg1提高了大鼠的肺功能，大鼠肺组织中MDA的含量降低，SOD的活性和GSH的含量升高，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也降低；同时，大鼠肺组织受损减轻，炎性细胞浸润减少，大鼠肺组织中COX-2、iNOS、Nrf2和HO-1蛋白表达水平下调。因此，GRg1对OSAHS有一定的治疗作用。

综上所述，GRg1减弱了COX-2和iNOS的表达并抑制Nrf2的核易位，从而抑制了下游HO-1基因的转录并减弱了氧化应激反应，为临床治疗OSAHS提供了新的理论依据。