溶酶体和线粒体靶向的pH可激活荧光探针研究

王玉敏(云南师范大学，云南 昆明 650500)

0 引言

水合氢离子是生物系统中具有关键作用的物种。在生物体中细胞、体液、器官中的酸碱稳态与很多生物过程有关，如：细胞的增殖与凋亡、内吞作用、离子转运等[1-2]。哺乳动物的细胞内pH 的范围从4.5(溶酶体)到8.0(线粒体)。

1 溶酶体和线粒体pH 值对细胞生物过程的重要意义

溶酶体是细胞中的“消化车间”，含有多种水解酶，可以降解大多数生物分子[3-4]。在酸性环境中，pH 在4.5～5.5 的范围内水解酶保持最佳的生物活性以进行消化和降解。对于癌细胞而言，细胞质和溶酶体中的pH 值均低于正常细胞[5]。溶酶体中pH 值的变化[6]可反映细胞状态和代谢过程。线粒体是有氧呼吸和代谢的主要部位，是能源生产的主要细胞器[7]。此外，线粒体还参与了各种新陈代谢过程[8]，包括细胞分化，钙离子稳态和细胞凋亡。细胞器中与pH 值变化有关的生物过程维持着生物体的正常功能，pH 值的轻微偏差会影响细胞的生理状态，而pH 值的异常变化可能会神经退行性疾病甚至癌症[9]等多种疾病。

2 亚细胞器靶向的pH可激活荧光探针的重要意义

近年来，随着共聚焦激光显微镜分辨率的提高，pH 荧光探针已应用于细胞成像。细胞成像使人们能够更加深入地了解亚细胞结构(如：溶酶体和线粒体)，为人们更好地了解与pH 有关的生理和病理过程提供了一种可能。近两年来，已经开发出了溶酶体和线粒体靶向的pH 可激活的荧光探针。在这篇评论中，我们总结了已报道的两种pH 荧光探针并探讨了它们的结构设计、识别机理以及生物学应用。

3 溶酶体靶向的pH 可激活荧光探针

溶酶体是真核细胞具有的膜结合囊泡。在解离状态下两亲性小分子能够渗透溶酶体膜，但质子化后在酸性溶酶体中不渗透。

一般来说，在荧光探针分子中引入二甲基氨基，氰基和吗啉的结构用于溶酶体定位。接下来，我们将讨论最近刚刚报道的基于吗啉基团的溶酶体靶向pH 可激活荧光探针。

课题组设计了探针1[10](如图1 所示)，该探针以吗啉为溶酶体靶向单元，罗丹明B 为荧光团，具有独特的五元螺环，在中性和碱性pH 值下，螺环封闭，罗丹明B 几乎不发荧光；在酸性条件下螺环打开时，会发出强烈的红色荧光。此外，探针1 还有具有良好的光物理特性，极好的光稳定性以及低细胞毒性，因而探针1 适用于活细胞成像。pH 滴定研究表明探针1 在590 nm 处，出现荧光增强。在pH 范围5.00～6.00 之间，pH 与荧光强度具有良好的线性关系，其pKa 值为5.42，适用于溶酶体pH成像。因此该探针在理解亚细胞器功能和溶酶体相关疾病的方面具有巨大的潜力。

图1 荧光探针1的识别机理

4 线粒体靶向的pH 可激活荧光探针

线粒体具有磷脂双层和蛋白质组成的外膜和内膜。根据能斯特方程，线粒体内膜上的电化学势能累积亲脂阳离子，在荧光探针的荧光团上引入亲脂性阳离子，即可设计成线粒体靶向的荧光探针。一般来说，阳离子部分不参与检测过程，仅用于线粒体定位。接下来，我们将讨论最近刚刚报道的线粒体靶向pH可激活荧光探针。

近年来通过在半菁和罗丹明染料中引入闭合螺内酰胺环结构，设计合成的中性或弱碱荧光探针，使螺内酰胺开环的pKa 值低，可靶向溶酶体而不是线粒体。理想的具有线粒体靶向能力的荧光探针，应具有较高的pKa 值，基于此Tajiri 课题组通过将恶唑烷开关引入半菁染料设计合成了可以靶向监测活细胞内线粒体pH 变化的近红外荧光探针2[11]。探针2 的半花青染料发生闭环反应，形成恶唑烷开关，游离羟基参与对吲哚部分的亲核攻击，导致荧光猝灭。在酸性条件下恶唑烷开关转换为半花青素，π 共轭体系增大，并导致725 nm 处的荧光增强。当pH 从10.0 降低至5.0 时，吸光度在713 nm 处增加。探针2 还具有良好的光稳定性，对pH 的适度选择性，低细胞毒性和荧光可逆性。此外探针2 还成功应用于HeLa 细胞线粒体pH的测定以及荧光成像分析。荧光探针2的识别机理如图2所示。

图2 荧光探针2的识别机理

5 亚细胞器靶向的pH 可激活的荧光探针小结

综上所述溶酶体靶向的探针1 具有荧光开启特征，以酰胺键为H+识别位点，在酸性条件下，五元螺环被打开，释放出荧光团，吗啉定位基可以特异性的定位在溶酶体中，可以高灵敏度地测量溶酶体的pH 值。线粒体靶向探针2 具有恶唑烷开关，在酸性条件下，恶唑烷开关转换为带正电荷的半花青染料，释放出荧光团的同时定位在线粒体中，可以高灵敏度地测量线粒体的pH 值。

两种亚细胞器靶向pH 可激活的荧光探针均具有可视化细胞内pH 分布和pH 变化的能力，能够帮助人们了解复杂的生理和病理过程，具有广阔的应用潜力。