米粉中金黄色葡萄球菌定量检测盲样 考核结果与分析

◎ 谭艳妮，曹明明，李欣蔚，张 健，施 法

（1.沈阳食品药品检验所，辽宁 沈阳 110136；2.沈阳沈化院测试技术有限公司，辽宁 沈阳 110021；3.辽宁省粮食科学研究所，辽宁 沈阳 110032）

金黄色葡萄球菌是引起食源性疾病的重要致病菌，分布较为广泛，可污染食物、水源等，严重威胁着人类的身体健康[1-2]。《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[3]中肉制品、水产制品、粮食制品、即食豆类制品、即食果蔬制品（包含酱腌菜）、饮料及即食调味品都对金黄色葡萄球菌进行了限量要求，可见金黄色葡萄球菌的检测在食品安全检验中具有重要意义[4]。盲样考核是为了保证各级食品安全承检机构检测结果准确可靠，提高检验检测水平，并以监督和考核为目的的测评活动。2020年10月，沈阳市食品药品检验所参加了由中国计量科学研究院组织实施总局本级食品安全承检机构盲样考核测评活动，检验项目为“米粉中金黄色葡萄球菌的定量检测”，最终结果为“满意”。为提高实验室工作质量，总结经验，将实验过程进行回顾分析。

1 材料与方法

1.1 样品

2个浓度水平的金黄色葡萄球菌样品各1瓶，棕色西林瓶包装，每瓶0.5 g，样品编号为MDJP036和MDJP007；避光、-20 ℃储存；样品中菌数的参考范围：1.0×103～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培养基及试剂

Baird-Parker琼脂平板，即用型培养基，编号：024040A，广东环凯微生物科技有限公司提供；脑-心浸出液肉汤（BHI），编号：GCM917B，北京陆桥技术股份有限公司提供；血平板，即用型培养基，编号：024070，广东环凯微生物科技有限公司提供；冻干血浆环，编号：029180，广东环凯微生物科技有限公司提供；营养琼脂，编号：GCM107，北京陆桥技术股份有限公司提供；磷酸盐缓冲液（贮存液），编号：CM1022，北京陆桥技术股份有限公司提供；革兰氏染色液；营养肉汤，编号：CM106，北京陆桥技术股份有限公司提供。。

1.3 标准菌株

表皮葡萄球菌，编号：CMCC（B）26069，购自中国医学细菌菌种保藏管理中心；金黄色葡萄球菌，编号：ATCC 6538，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.4 仪器设备与耗材

1300 series A2生 物 安 全 柜（Thermo Fisher）、IMH400-S电热恒温培养箱（Thermo Scientific）、LBI-250生化培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）、SX-700 高压灭菌器（Tomy Autoclave) ）、微量移液器（Sartorius）、 移液器吸头（Brand）、显微镜（Olympus）及一次性接种环（As One）。

1.5 方法

1.5.1 样品前处理

将装有考核样品MFJP036，MFJP007的西林瓶逐瓶从-20 ℃冰箱中取出，在室温下放置5 min。在生物安全柜中进行无菌操作，打开西林瓶，向每瓶样品直接加入4.5 mL磷酸盐缓冲液复溶，充分混匀后得到1∶10稀释度的样品匀液。吸取1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。按照上述操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次无菌吸头。

1.5.2 样品接种

根据样品参考范围1.0×103CFU·g-1到1.0×106CFU·g-1， 选择10-2～10-8稀释度的样品匀液，进行检测，每个稀释度分别吸取样品匀液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别加入3块Baird-Parker平板，用无菌涂布棒涂布整个平板。

1.5.3 培养

涂布后，将平板正置于培养箱36 ℃培养1 h，待样品匀液吸收后，翻转平板，倒置培养至48 h。

2 结果与分析

2.1 典型菌落计数

本次盲样考核共有样品2份，每个样品进行3次平行测定，每个稀释梯度接种3块Baird-Parker平板，根据作业指导书中给出的菌落范围进行梯度稀释，结果每份样品均只有10-1、10-2、10-3稀释度检出，平板上典型菌落数见表1。

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，边缘浅色，周围绕以不透明圈，其外有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感[5]。对于典型菌落必须进行革兰氏染色，血平板划线以及血浆凝固酶等试验才能最终进行判断，沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征与金黄色葡萄球菌相当接近，肉眼无法区分，会导致最终假阳性判断。

表1 金黄色葡萄球菌定量检测平板计数结果表

2.2 染色镜检

样品MDJP036和MDJP007典型菌落革兰氏染色镜检结果为G+球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5～1.0 μm，如图1所示。

图1 样品典型菌落革兰氏染色镜检结果图

2.3 血浆凝固酶试验

每只冻干血浆西林瓶加入0.5 mL灭菌生理盐水至完全溶解，再加入BHI肉汤培养物0.3 mL，充分混匀，盖好西林瓶塞，置于36 ℃培养箱内，每半小时观察一次，观察6 h，考核样品MFJP036、MFJP007于培养3 h 后凝固，判定为阳性结果。同时阳性对照也于培养3 h后凝固，阴性对照和空白对照培养6 h后仍未凝固[6]。

3 结论与讨论

本次盲样考核结果中的两份样品，米粉中金黄色葡萄球菌定量检测的Baird-Parker平板计数结果Z值均小于2，为满意结果。

本次考核样品基质为米粉，在试验前应考虑到基质可能会存在不易溶解的特质，因此在稀释过程中应注意混匀，防止其对计数结果产生影响；所有即用型Baird-Parker平板培养基在使用前，应放在36 ℃培养箱里干燥至表面水珠消失，防止涂布时因有水珠导致结果不准确；本次试验严格按照GB 4789.10—2016中规定的培养基及试剂进行培养和测定，为确保结果准确，今后可加用金黄色葡萄球菌显色培养基来降低干扰菌的影响，防止对典型菌落的错判和漏判[7]。