肝细胞肝癌组织中硫氧还蛋白9 表达水平与经肝动脉化疗栓塞术治疗疗效的关系
2021-05-20潘杨军章喜林陆伟杰郑银元
潘杨军, 王 耀, 章喜林, 陆伟杰, 郑银元
肝细胞肝癌(HCC)血供丰富,90%以上血供来自于肝动脉[1]。 TACE 已被公认为治疗HCC 的有效手段之一[2]。 有报道显示,相同肿瘤分期的HCC 患者接受TACE 治疗,但疗效不尽相同[3]。筛选适合接受TACE 治疗的HCC 患者可有效降低医疗成本,达到精准医疗的目的。 因此,探寻灵敏度和特异度均较高的生物标志物评价HCC 患者TACE 疗效具有重要意义。
硫氧还蛋白9(thioredoxin domain containing protein 9,TXNDC9)是一种具有ATP 结合蛋白活性的硫氧还蛋白[4]。 有研究表明敲除TXNDC9 基因可抑制MYC 与染色质结合[5],从而抑制HCC 细胞生长。 此外,TXNDC9 还可通过靶向核因子E2 相关因子2(nuclear factor-E2 related factor2,Nrf2)调节自噬,从而减弱大肠癌细胞对奥沙利铂的灵敏度[6]。从而推测,HCC 组织中TXNDC9 水平能反映TACE 疗效,遂开展本研究,以期为HCC 患者选择合适的治疗方案提供参考。 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 入选患者临床资料
选择2013 年1 月至2016 年1 月诊断为HCC的97 例患者作为研究对象。 根据《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[7]诊断HCC 并进行治疗。 纳入标准:①年龄18~70 岁;②病理活检确诊为HCC;③接受TACE 治疗;④Child-Pugh 分级A 或B;⑤能配合完成相关检查及随访; ⑥签署了知情同意书;⑦有保存在液氮罐中完好的肿瘤组织(经皮穿刺活检获取)。排除标准:①TACE 治疗禁忌证;②肿瘤分期Ⅲb 期或Ⅳ期患者;③美国东部协作组(ECOG)评分高于2 分;④接受射频消融术、微波消融术或靶向药物治疗等。 收集患者年龄、性别、乙肝表面抗原(HBsAg)、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、肿瘤直径、甲胎蛋白(AFP)等临床资料。 97 例HCC 患者中男性66 例,女性31 例,年龄51~70 岁,平均年龄(62.6±5.3)岁。 本研究经本院医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 TACE 治疗 ①术前常规检查患者肝、肾功能、血常规、尿常规、凝血功能及心电图等。 ②根据HCC 患者肿瘤位置确定手术姿势,常规消毒、铺巾,行局部麻醉。 采用Seldinger 改良法经股动脉置入导管鞘, 将其插管至肝总动脉或腹腔动脉处,行肿瘤病灶血管造影,了解其血供情况。了解清楚肿瘤病灶供血情况后将表柔比星、奥沙利铂和超液化碘油的混悬液灌注至肿瘤供血动脉。 术中根据肿瘤病灶血供及大小决定乳化剂的用量,确保完全栓塞肿瘤供血动脉。③术后密切观察患者有无TACE 并发症发生,若出现发热、肝区闷痛、恶心等,则给予对症处理。 针对TACE治疗疗效较差的患者,根据患者病情给予针对性治疗。
1.2.2 HCC 组织中TXNDC9 水平检测 用蛋白质免疫印迹法检测HCC 组织中TXNDC9 水平[8]。实验步骤:①滴加RIPA 裂解液裂解细胞,4℃4 000 r/min离心10 min,离心半径8 cm,提取上层清液;②用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量;③80 V 凝胶电泳15 min,然后增加电压至120 V,直至溴酚蓝跑出胶 面; ④300 mA 转 膜60 min; ⑤滴 加 兔 抗 人TXNDC9 单克隆抗体,4℃孵育过夜, 第2 日滴加二抗,室温孵育1 h;⑥用ELC 电化学发光曝光显影,最后用Image J 软件分析结果。 本实验所用抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2.3 TACE 治疗疗效评价 用实体瘤疗效评价标准的修订标准(mRECIST)[9]评价首次TACE 治疗的疗效。完全缓解(CR)为CT 或MRI 检查所有目标病灶内动脉期无增强显影;部分缓解(PR)为CT 或MRI检查目标病灶的直径总和降低30%;疾病稳定(SD)为CT 或MRI 检查目标病灶的直径总和降低(未达到PR 标准)或升高程度低于20%;疾病进展(PD)为CT 或MRI 检查目标病灶的直径总和升高20%或有新病灶出现。
1.2.4 随访 于出院后1 个月复查CT 或MRI,了解HCC 患者碘油沉积情况、 肿块体积变化及有无新肿瘤病灶等。 第2 次及以后随访采用电话方式了解HCC 患者5 年生存预后情况。 每月随访1 次,末次随访时间为2020 年2 月16 日,平均随访时间为43.74(6~60)个月。
1.3 统计学分析
用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。 正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示,四组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用S-N-K 检验。 计数资料用例或率[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验。用Spearman 相关分析TXNDC9 水平与TACE治疗疗效的关系。 用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评价TXNDC9 诊断HCC 预后的效能。 用Kaplan-Meier 绘制TXNDC9≥0.94 和TXNDC9<0.94的HCC 患者生存曲线,用Log-Rank 法比较差异。用Cox 回归分析影响HCC 患者预后的因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组基线资料
97 例HCC 患者首次接受TACE 治疗后,17 例(17.53%)CR,30 例(30.93%)PR,21 例(21.65%)SD,29 例(29.90%)PD。四组在年龄、性别、HBsAg、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、肿瘤直径和AFP 方面比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),见表1。
表1 各组基线资料比较 n(%)
2.2 HCC 患者TACE 疗效与TXNDC9 的关系
CR 组、PR 组、SD 组 和PD 组HCC 组 织 中TXNDC9 水平分别为0.66±0.09、0.75±0.09、0.94±0.12 和1.08±0.11,差异有显著统计学意义(F=77.815,P<0.001)。CR 组TXNDC9 水平低于PR 组、SD 组和PD 组,差异均有统计学意义(q=3.933、11.655、18.501,P<0.05)。PR 组TXNDC9 水平低于SD 组和PD 组,差异均有统计学意义(q=9.167、17.117,P<0.05)。 SD 组TXNDC9水平低于PD 组,差异有统计学意义(q=6.453,P<0.05)。HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE 治疗疗效呈负相关关系(rs=-0.849,P<0.001)。
2.3 HCC 预后与TXNDC9 的关系
97 例HCC 患者1 年、3 年和5 年生存率分别为84.5%(82/97)、68.0%(66/97)和52.6%(51/97)。TXNDC9 诊断HCC 预后的ROC AUC 为0.930(95%CI:0.859~0.972),最大约登指数为0.700,其 所对应的最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.9、73.9%和96.1%,见图1。以TXNDC9 诊断HCC 预后的最佳截断点为界,将HCC 患者分为两组:TXNDC9≥0.94 组(n=37)和TXNDC9<0.94 组(n=60)。TXNDC9≥0.94 组中位生存时间低于TXNDC9<0.94 组(24个月比60 个月),差异有显著统计学意义(Log-Rank Chi-square=64.538,P<0.001),见图2。
图1 TXNDC9 诊断HCC 预后的ROC 曲线
2.4 影响HCC 预后的因素分析
将HCC 患者预后(生存=0,死亡=1)作为因变量,将年龄、性别(女=0,男=1)、HBsAg(-=0,+=1)、Child-Pugh 分级(A=0,B=1)、肿瘤数目(1 个=0,≥2个=1)、肿瘤直径、AFP 和TXNDC9 作为自变量纳入单因素Cox 回归分析, 结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 与HCC 预后有关(P<0.05)。将年龄、肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 作为自变量(纳入标准P≤0.1),将HCC 患者预后作为因变量纳入多因素Cox 回归分析,结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 是HCC 患者预后的独立危险因素(P<0.05),见表2。
图2 不同TXNDC9 水平HCC 患者生存曲线
3 讨论
目前,临床多采用CT 或MRI 等影像学检查手段了解TACE 治疗后碘油沉积及肿瘤体积变化等情况评价TACE 治疗效果。 但CT 或MRI 等影像学检查费用较贵, 多次复查了解HCC 病灶变化会增加患者辐射和经济负担,需探寻一种准确率高且检查费用低的生物标志物评价TACE 治疗疗效。 有学者用平均血小板容积评价TACE 治疗HCC 的疗效,结果显示TACE 术前及术后平均血小板容积值的变化在TACE 术后疗效评估方面有一定价值[10]。 但对于骨髓造血功能异常的HCC 患者而言, 平均血小板容积值异常,用其评价TACE 术后疗效的准确度会大大降低。 此外,化疗药物也会对骨髓造血功能有一定影响,进而影响平均血小板容积值,因此,单纯用平均血小板容积评价TACE 治疗疗效不适用于合并全身化疗或有造血功能异常的HCC 患者。 此外,还有学者用血清白细胞介素-6 和γ 谷氨酰转移酶评价TACE 治疗疗效,结果显示二者联合对TACE 治疗疗效及预后评价的价值较高[11]。 白细胞介素-6 在炎症性疾病中高表达,γ 谷氨酰转移酶在肝纤维化中表达异常,因此,对于合并炎症性疾病或肝纤维化的HCC 患者, 采用白细胞介素-6 和γ 谷氨酰转移酶评价TACE 治疗疗效, 其准确性有待考证。
表2 影响HCC 患者预后的因素分析
TXNDC9是硫氧还蛋白家族中成员, 在抗氧化应激损伤中具有重要作用[12]。 目前,已有研究证实TXNDC9 在 前 列 腺 癌[13]、肝 细 胞 癌[5]和 大 肠 癌[14]中高表达,并参与肿瘤进展。 癌细胞自噬水平已被证实与化疗耐药密切相关[15-17]。干扰TXNDC9 表达,大肠癌细胞中Nrf2 水平也随之降低,进而阻断了细胞自噬过程,同时细胞凋亡蛋白表达水平升高,在奥沙利铂诱导下凋亡[6]。 笔者推测HCC 细胞也通过TXNDC9/Nrf2 通路调控自噬水平,进而下调对化疗药物的灵敏度。 检测HCC 组织中TXNDC9 可反映TACE 治疗疗效。
本研究通过比较CR 组、PR 组、SD 组和PD 组HCC 组织中TXNDC9 水平,结果显示其水平依次升高, 此外,HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE 治疗疗效呈负相关关系。 上述结果证实了课题组推测,HCC 组织中TXNDC9 水平能反映TACE 治疗疗效。为进一步分析HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE治疗远期疗效的关系, 本课题对接受TACE 治疗的HCC 患者进行了随访,结果显示其1 年、3 年和5 年生存率分别为84.54%、68.04%和52.58%,与伏旭等[18]随访结果接近。 构建TXNDC9 诊断HCC预后的ROC 曲线,结果显示其ROC AUC、灵敏度和特异度分别为0.930、73.91%和96.08%,该结果提示TXNDC9 对HCC 预后评估有极高价值,但灵敏度较低,可辅助评价HCC 患者预后。 进一步采用单因素和多因素Cox 回归分析影响HCC 患者预后的因素,结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9是HCC 患者预后的独立预测因素。 张长坤等[19]、刘光华等[20]研究表明,伴随HCC 肿瘤直径增加和Child-Pugh 分级增高, 患者预后不良风险也随之增加。 推测HCC 组织中TXNDC9 水平高,表明癌细胞调节自噬的能力强, 进而对化疗药物灵敏度降低,检测HCC 组织中TXNDC9 水平可反映癌细胞自噬水平,进而反映TACE 治疗疗效。
综上所述,HCC 组织中TXNDC9 水平高, 提示患者接受TACE 治疗疗效较差,获益较低。 此外,高TXNDC9 水平还表明HCC 患者预后不良风险较高。检测HCC 组织中TXNDC9 水平可辅助评价TACE治疗疗效及远期预后。 课题组下一步将开展基础研究,阐明TXNDC9 与化疗灵敏度的关系。