肝细胞肝癌组织中硫氧还蛋白9 表达水平与经肝动脉化疗栓塞术治疗疗效的关系

潘杨军， 王 耀， 章喜林， 陆伟杰， 郑银元

肝细胞肝癌（HCC）血供丰富，90%以上血供来自于肝动脉［1］。 TACE 已被公认为治疗HCC 的有效手段之一［2］。 有报道显示，相同肿瘤分期的HCC 患者接受TACE 治疗，但疗效不尽相同［3］。筛选适合接受TACE 治疗的HCC 患者可有效降低医疗成本，达到精准医疗的目的。 因此，探寻灵敏度和特异度均较高的生物标志物评价HCC 患者TACE 疗效具有重要意义。

硫氧还蛋白9（thioredoxin domain containing protein 9，TXNDC9）是一种具有ATP 结合蛋白活性的硫氧还蛋白［4］。 有研究表明敲除TXNDC9 基因可抑制MYC 与染色质结合［5］，从而抑制HCC 细胞生长。 此外，TXNDC9 还可通过靶向核因子E2 相关因子2（nuclear factor-E2 related factor2，Nrf2）调节自噬，从而减弱大肠癌细胞对奥沙利铂的灵敏度［6］。从而推测，HCC 组织中TXNDC9 水平能反映TACE 疗效，遂开展本研究，以期为HCC 患者选择合适的治疗方案提供参考。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 入选患者临床资料

选择2013 年1 月至2016 年1 月诊断为HCC的97 例患者作为研究对象。 根据《原发性肝癌规范化诊治专家共识》［7］诊断HCC 并进行治疗。 纳入标准：①年龄18～70 岁；②病理活检确诊为HCC；③接受TACE 治疗；④Child-Pugh 分级A 或B；⑤能配合完成相关检查及随访； ⑥签署了知情同意书；⑦有保存在液氮罐中完好的肿瘤组织（经皮穿刺活检获取）。排除标准：①TACE 治疗禁忌证；②肿瘤分期Ⅲb 期或Ⅳ期患者；③美国东部协作组（ECOG）评分高于2 分；④接受射频消融术、微波消融术或靶向药物治疗等。 收集患者年龄、性别、乙肝表面抗原（HBsAg）、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、肿瘤直径、甲胎蛋白（AFP）等临床资料。 97 例HCC 患者中男性66 例，女性31 例，年龄51～70 岁，平均年龄（62.6±5.3）岁。 本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 TACE 治疗 ①术前常规检查患者肝、肾功能、血常规、尿常规、凝血功能及心电图等。 ②根据HCC 患者肿瘤位置确定手术姿势，常规消毒、铺巾，行局部麻醉。 采用Seldinger 改良法经股动脉置入导管鞘， 将其插管至肝总动脉或腹腔动脉处，行肿瘤病灶血管造影，了解其血供情况。了解清楚肿瘤病灶供血情况后将表柔比星、奥沙利铂和超液化碘油的混悬液灌注至肿瘤供血动脉。 术中根据肿瘤病灶血供及大小决定乳化剂的用量，确保完全栓塞肿瘤供血动脉。③术后密切观察患者有无TACE 并发症发生，若出现发热、肝区闷痛、恶心等，则给予对症处理。 针对TACE治疗疗效较差的患者，根据患者病情给予针对性治疗。

1.2.2 HCC 组织中TXNDC9 水平检测 用蛋白质免疫印迹法检测HCC 组织中TXNDC9 水平［8］。实验步骤：①滴加RIPA 裂解液裂解细胞，4℃4 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，提取上层清液；②用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；③80 V 凝胶电泳15 min，然后增加电压至120 V，直至溴酚蓝跑出胶 面； ④300 mA 转 膜60 min； ⑤滴 加 兔 抗 人TXNDC9 单克隆抗体，4℃孵育过夜， 第2 日滴加二抗，室温孵育1 h；⑥用ELC 电化学发光曝光显影，最后用Image J 软件分析结果。 本实验所用抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.3 TACE 治疗疗效评价 用实体瘤疗效评价标准的修订标准（mRECIST）［9］评价首次TACE 治疗的疗效。完全缓解（CR）为CT 或MRI 检查所有目标病灶内动脉期无增强显影；部分缓解（PR）为CT 或MRI检查目标病灶的直径总和降低30%；疾病稳定（SD）为CT 或MRI 检查目标病灶的直径总和降低（未达到PR 标准）或升高程度低于20%；疾病进展（PD）为CT 或MRI 检查目标病灶的直径总和升高20%或有新病灶出现。

1.2.4 随访 于出院后1 个月复查CT 或MRI，了解HCC 患者碘油沉积情况、 肿块体积变化及有无新肿瘤病灶等。 第2 次及以后随访采用电话方式了解HCC 患者5 年生存预后情况。 每月随访1 次，末次随访时间为2020 年2 月16 日，平均随访时间为43.74（6～60）个月。

1.3 统计学分析

用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。 正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，四组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用S-N-K 检验。 计数资料用例或率［n（%）］表示，组间比较采用χ2检验。用Spearman 相关分析TXNDC9 水平与TACE治疗疗效的关系。 用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评价TXNDC9 诊断HCC 预后的效能。 用Kaplan-Meier 绘制TXNDC9≥0.94 和TXNDC9＜0.94的HCC 患者生存曲线，用Log-Rank 法比较差异。用Cox 回归分析影响HCC 患者预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组基线资料

97 例HCC 患者首次接受TACE 治疗后，17 例（17.53%）CR，30 例（30.93%）PR，21 例（21.65%）SD，29 例（29.90%）PD。四组在年龄、性别、HBsAg、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、肿瘤直径和AFP 方面比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 各组基线资料比较 n（%）

2.2 HCC 患者TACE 疗效与TXNDC9 的关系

CR 组、PR 组、SD 组 和PD 组HCC 组 织 中TXNDC9 水平分别为0.66±0.09、0.75±0.09、0.94±0.12 和1.08±0.11，差异有显著统计学意义（F=77.815，P＜0.001）。CR 组TXNDC9 水平低于PR 组、SD 组和PD 组，差异均有统计学意义（q=3.933、11.655、18.501，P＜0.05）。PR 组TXNDC9 水平低于SD 组和PD 组，差异均有统计学意义（q=9.167、17.117，P＜0.05）。 SD 组TXNDC9水平低于PD 组，差异有统计学意义（q=6.453，P＜0.05）。HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE 治疗疗效呈负相关关系（rs=-0.849，P＜0.001）。

2.3 HCC 预后与TXNDC9 的关系

97 例HCC 患者1 年、3 年和5 年生存率分别为84.5%（82/97）、68.0%（66/97）和52.6%（51/97）。TXNDC9 诊断HCC 预后的ROC AUC 为0.930（95%CI：0.859～0.972），最大约登指数为0.700，其 所对应的最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.9、73.9%和96.1%，见图1。以TXNDC9 诊断HCC 预后的最佳截断点为界，将HCC 患者分为两组：TXNDC9≥0.94 组（n=37）和TXNDC9＜0.94 组（n=60）。TXNDC9≥0.94 组中位生存时间低于TXNDC9＜0.94 组（24个月比60 个月），差异有显著统计学意义（Log-Rank Chi-square=64.538，P＜0.001），见图2。

图1 TXNDC9 诊断HCC 预后的ROC 曲线

2.4 影响HCC 预后的因素分析

将HCC 患者预后（生存=0，死亡=1）作为因变量，将年龄、性别（女=0，男=1）、HBsAg（－=0，＋=1）、Child-Pugh 分级（A=0，B=1）、肿瘤数目（1 个=0，≥2个=1）、肿瘤直径、AFP 和TXNDC9 作为自变量纳入单因素Cox 回归分析， 结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 与HCC 预后有关（P＜0.05）。将年龄、肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 作为自变量（纳入标准P≤0.1），将HCC 患者预后作为因变量纳入多因素Cox 回归分析，结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9 是HCC 患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表2。

图2 不同TXNDC9 水平HCC 患者生存曲线

3 讨论

目前，临床多采用CT 或MRI 等影像学检查手段了解TACE 治疗后碘油沉积及肿瘤体积变化等情况评价TACE 治疗效果。 但CT 或MRI 等影像学检查费用较贵， 多次复查了解HCC 病灶变化会增加患者辐射和经济负担，需探寻一种准确率高且检查费用低的生物标志物评价TACE 治疗疗效。 有学者用平均血小板容积评价TACE 治疗HCC 的疗效，结果显示TACE 术前及术后平均血小板容积值的变化在TACE 术后疗效评估方面有一定价值［10］。 但对于骨髓造血功能异常的HCC 患者而言， 平均血小板容积值异常，用其评价TACE 术后疗效的准确度会大大降低。 此外，化疗药物也会对骨髓造血功能有一定影响，进而影响平均血小板容积值，因此，单纯用平均血小板容积评价TACE 治疗疗效不适用于合并全身化疗或有造血功能异常的HCC 患者。 此外，还有学者用血清白细胞介素-6 和γ 谷氨酰转移酶评价TACE 治疗疗效，结果显示二者联合对TACE 治疗疗效及预后评价的价值较高［11］。 白细胞介素-6 在炎症性疾病中高表达，γ 谷氨酰转移酶在肝纤维化中表达异常，因此，对于合并炎症性疾病或肝纤维化的HCC 患者， 采用白细胞介素-6 和γ 谷氨酰转移酶评价TACE 治疗疗效， 其准确性有待考证。

表2 影响HCC 患者预后的因素分析

TXNDC9是硫氧还蛋白家族中成员， 在抗氧化应激损伤中具有重要作用［12］。 目前，已有研究证实TXNDC9 在 前 列 腺 癌［13］、肝 细 胞 癌［5］和 大 肠 癌［14］中高表达，并参与肿瘤进展。 癌细胞自噬水平已被证实与化疗耐药密切相关［15-17］。干扰TXNDC9 表达，大肠癌细胞中Nrf2 水平也随之降低，进而阻断了细胞自噬过程，同时细胞凋亡蛋白表达水平升高，在奥沙利铂诱导下凋亡［6］。 笔者推测HCC 细胞也通过TXNDC9/Nrf2 通路调控自噬水平，进而下调对化疗药物的灵敏度。 检测HCC 组织中TXNDC9 可反映TACE 治疗疗效。

本研究通过比较CR 组、PR 组、SD 组和PD 组HCC 组织中TXNDC9 水平，结果显示其水平依次升高， 此外，HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE 治疗疗效呈负相关关系。 上述结果证实了课题组推测，HCC 组织中TXNDC9 水平能反映TACE 治疗疗效。为进一步分析HCC 组织中TXNDC9 水平与TACE治疗远期疗效的关系， 本课题对接受TACE 治疗的HCC 患者进行了随访，结果显示其1 年、3 年和5 年生存率分别为84.54%、68.04%和52.58%，与伏旭等［18］随访结果接近。 构建TXNDC9 诊断HCC预后的ROC 曲线，结果显示其ROC AUC、灵敏度和特异度分别为0.930、73.91%和96.08%，该结果提示TXNDC9 对HCC 预后评估有极高价值，但灵敏度较低，可辅助评价HCC 患者预后。 进一步采用单因素和多因素Cox 回归分析影响HCC 患者预后的因素，结果显示肿瘤直径、Child-Pugh 分级和TXNDC9是HCC 患者预后的独立预测因素。 张长坤等［19］、刘光华等［20］研究表明，伴随HCC 肿瘤直径增加和Child-Pugh 分级增高， 患者预后不良风险也随之增加。 推测HCC 组织中TXNDC9 水平高，表明癌细胞调节自噬的能力强， 进而对化疗药物灵敏度降低，检测HCC 组织中TXNDC9 水平可反映癌细胞自噬水平，进而反映TACE 治疗疗效。

综上所述，HCC 组织中TXNDC9 水平高， 提示患者接受TACE 治疗疗效较差，获益较低。 此外，高TXNDC9 水平还表明HCC 患者预后不良风险较高。检测HCC 组织中TXNDC9 水平可辅助评价TACE治疗疗效及远期预后。 课题组下一步将开展基础研究，阐明TXNDC9 与化疗灵敏度的关系。