染色体微阵列分析对智力障碍/发育迟缓患儿病因检测的应用

汤镇川 童光磊 李 红 周陶成 徐艳红

智力障碍（ID）/发育迟缓（DD）是儿童康复学科临床诊治中最为多见的疾病之一，严重影响儿童的身心健康。全球人口中发病率约占3%，而中国的发病率约为0.9%，其中年龄在6岁以下的就有95.4万人[1]。其特征表现为在18岁之前，智力能力落后同阶段的儿童且在两项或多项适应性技能方面（例如自我护理，沟通技能，解决问题和逻辑思维）存在极大限制[2]。国内大多数ID/DD儿童因为病因不明而延误了最佳康复治疗时期。染色体微阵列分析（CMA)是目前国际公认用于不明原因ID/DD儿童的一线诊断方法，有别于传统的细胞遗传学诊断方法[3]。它能为ID/DD遗传病因学上的精准诊断提供更高的分辨率，检测到基因拷贝数异常（CNV），从而发现各种CNV导致的微缺失或微重复综合征，给病因诊断带来新的进展。本研究收集了149例不明原因ID/DD患儿，利用CMA技术进行遗传病因学检测，旨在进一步为临床上诊断ID/DD患儿病因提供科学可靠的理论依据，更好地进行早期针对性综合康复治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年6月-2019年12月于本医院就诊的不明原因ID/DD患儿共149例，男性80例，女性69例。本研究方案经安徽省儿童医院伦理委员会审批通过，患儿或其家长签署知情同意书。诊断标准：按照不同年龄段采取不同的测试方法：Gesell发育量表适用于0～4岁儿童，中国-韦氏幼儿智力量表（C-WYCSI）适用于4～6岁，中国韦氏学龄儿童智力量表（C-WISC）适用于6岁以上儿童。同时所有患儿日常生活活动能力（ADL）则通过婴儿-初中学生社会生活能力量表进行评估。当DQ或IQ低于70，伴ADL低下，对年龄大于5岁的患儿诊断为ID，对年龄小于5岁称为DD。

1.2 纳入及排除标准 ①纳入标准：符合ID/DD诊断。获得患儿或家长知情同意。②排除标准：通过染色体核型分析及遗传代谢性血、尿筛查可明确的病因；明确的颅脑外伤，生后患有中枢系统感染性疾病；未同意基因检测或相关临床信息不完善者。

1.3 方法 收集患儿的相关临床病史并进行CMA检测：用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集患儿静脉血2 mL，严格采用Affymetrix公司配套检测试剂盒及优化的标准操作流程，使用CytoScan 750K芯片进行全基因组范围扫描，包括DNA提取、酶切、连接、PCR，PCR产物纯化、片段化、标记、杂交、扫描和结果分析等步骤。CytoScanR 750K芯片的探针是从CytoScanR HD芯片上精选出来的75万多个探针，由55万个CNV探针和20万个基因分型精确度高达99%的SNP探针组成，以平均大约1个探针标记/4 kb的密度分布于人类的整个基因组。随后通过Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software软件分析数据，根据检测到的CNV与DGV、ClinGen、DECIPHER、lSCA、OMlM等公共数据库及相关文献报道对比来明确CNV类型。美国遗传学学会（ACMG）将CMA检测出的CNV分为五大类：致病性CNV，可能致病性CNV，可能良性CNV和良性CNV，临床意义不明确CNV[4]。

2 结 果

2.1 36 例致病性CNV患儿的CMA检测结果分析 CMA在149例不明原因ID/DD患儿中检测出致病性CNV共36例，占24.2%（36/149），片段大小范围在0.15Mb到15.4Mb之间。其中包括28例微缺失和8例微重复，现数据库及文献报道过的已知综合征有26例：而数据库中暂未定义的综合征的致病性CNV有11例。见表1。

表1 36例致病性CNV患儿CMA检测结果

2.2 36 例致病性CNV患儿临床症状分析 在36例致病性CNV患儿中，男性19例，女性17例，伴先天发育畸形和特殊面容的有13例，占36.1%（13/36），伴孤独症谱系障碍（ASD）有4例，占11.1%(4/36)神经影像检查提示异常19例，占52.7%(19/36)，脑电图检查提示异常4例，占11.1%（4/36）。见表2。

表2 36例致病性CNV患儿临床症状

3 讨 论

ID/DD的病因复杂多样，通常是由于遗传和环境因素的相互作用引起的，而在明显存在认知障碍的儿童中遗传因素则更为突出[5]。Rauch A等[6]通过对670名智力障碍患儿病因探讨，发现39.5%的ID/DD与遗传原因有关，而1.3%是由于后天因素或环境因素造成的，还有50%～60%的人群未能明确病因。因此CMA的引入为ID/DD发病机制中的亚端粒重组突变的发现带来重大发展，并且突破传统检测技术在分辨率，基因组特异性和检测周期上的限制。

本研究利用CMA技术在149例ID/DD患儿中检测出36例致病性CNV患儿，阳性率为24.2%，与国内胡珺洁等[7]报道的22.1%，王荣跃等[8]报道的25.8%基本一致。而阳性率的高低起伏可能与样本量大小，检测技术平台不同，数据库及相关文献报道不断更新有关。例如在此次研究中有48例患儿为临床意义不明确CNV，对于这些儿童，必须由临床医生进行定期随访和重新评估，因为随着文献中丰富了更多临床和基因组数据，这些临床意义不明确CNV最终可能会被重新分类为致病性或良性的，随之相应的阳性率也会有所波动。

Williams–Beuren综合征其主要临床特征除了智力障碍、特殊面容以外，还表现为身材发育迟缓，内分泌紊乱（高钙血症），约80%的患者伴心血管畸形，如主动脉瓣上狭窄、肺动脉狭窄[9]。然而仅有病例10、11接近其临床表型，病例10的患儿还存在视神经发育障碍，可能与该综合征的GTF2IRD基因调控的视神经表达相关。病例8、9患儿特殊面容不明显，心脏彩超检查也未见明显异常，仅实验室检查提示血钙偏高。因15q11.2q13.1缺失导致的Angelman/Prader-Willi综合征检出5例，5例均患有轻到中度的智力障碍，临床表现及体征与综合征所报道的大致相仿[10]，特别是病例19为1岁11月的女孩，临床表现为精神运动发育迟滞，严重语言落后，癫痫，喜笑，与文献报道的天使综合征高度一致，该疾病是由于母源或父源遗传印记缺陷所致，人群中发病率约为1/15000[11]。

朱伯特综合征（Joubert syndrome）是罕见的一类源于感觉细胞器(原发性纤毛)的缺陷的疾病。该综合征涉及多个器官系统的疾病，包括大脑，眼睛和肾脏。常见症状包括呼吸异常，智力发育迟缓，肌张力异常和异常的眼球运动，神经影像学检查常有提示典型的“臼齿征[12]。朱伯特综合征涉及35个致病基因，不同基因调控着不同编码产物导致临床类型不尽相同[13]。病例1是一位3岁女孩，因智力发育迟缓就诊，有特殊面容，双眼睑下垂，右侧明显，右眼内斜视，双下肢肌张力异常，头颅磁共振检查提示“臼齿征”。患儿经CMA检查后显示2号染色体长臂2q13区域缺失，缺失片段长度为0.48Mb，包含一个OMIM基因NPHP1。其中NPHP1 突变可导致双眼视力退化，行走不能，运动发育迟缓等。该患儿除了常规的康复治疗外，在病因学上的明确后，未来的动物模型和靶向基因疗法的开发将有助于为患有这种挑战性疾病的患者提供个性化治疗。

FOXG1基因被认为与严重的Rett样表型有关。它点突变编码是对前脑发育至关重要的转录阻遏物。先天性rett综合征属于经典rett综合征的变异，临床表现多为智力低下，严重的言语发育障碍、癫痫等。病例2，女，3岁，表现为双眼可见水平震颤，言语认知能力低下，CMA提示先天性Rett综合征，继而完善B超检查提示左侧卵巢未探及。Rett变异型较为罕见，此次发现在一定程度上丰富了rett综合征和FOXG1基因突变的表型基因数据库，为进一步康复诊治个体化制定提供相关理论支撑。

Kleefstra综合征又称9q34.3微缺失综合征，是位于同一基因组区域的EHMT1基因突变导致的罕见遗传病。病例14、15为亲姐妹，智力水平远远落后同龄儿童，均有特殊面容，通过完善CMA检测，诊断为Kleefstra综合征。2例罕见综合征的发现更加完善相关数据库信息及临床表征内容，为临床医生在诊治ID/DD患儿提供更多的遗传病因学资料，所以对CNV进行包括详细临床表型评估在内的进一步研究是相当有必要。

据报道，人类基因组中随机重复频率可能低于缺失的频率[14]。本研究检测到全部CNV重复与缺失比例接近1:1，而致病性CNV患儿中微缺失和微重复比例为3.5:1，这表明人类基因组重复的耐受性优于缺失。换言之，使用CMA鉴定的CNV缺失比重复更可能是致病的。由于表型与基因型对应复杂多变，难以从表型推断出致病基因组区域，所以针对基因组失衡的靶向检测，全基因组CMA优于荧光原位杂交技术（FISH）。无论ID/DD患儿临床表现如何，是否有特殊面容和畸形，都应对不明原因的ID/DD患儿进行CMA检测。事实上，CMA也存在不少局限性，染色体平衡易位，倒位，点突变等方面就是CMA诊断的盲区。下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）等新兴技术可能会在将来克服CMA的这些局限性，但现今仍有一些问题需要解决，例如测序数据分析复杂，检验成本高等。因此，CMA仍是现今应用于ID/DD患儿遗传学病因检测的一线诊断方法。

研究表明CMA作为具有高通量、高分辨的一线分子遗传学的诊断技术，为我们深入认识到ID基因异常形成的机制和产前咨询提供了技术支持，也为我们能够寻找ID/遗传学诊断及相关治疗方式指引方向。在ID/DD患儿的遗传学诊断中非常具有临床实用性。对于所有ID/DD的儿童，应将CMA检测作为第一临床诊断测试。