桃红四物汤对肢体缺血-再灌注损伤大鼠骨骼肌 三磷酸肌醇受体表达的影响

李武平，李婕，刘宗义，易南，黄思琦，朱付平

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007； 2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

肢体缺血-再灌注损伤（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢体缺血损伤和再灌注损伤的合称，常继发于动脉损伤、动脉栓塞、挤压综合征、断肢再植、带血管蒂组织移植等疾病。目前医学界对缺血-再灌注损伤的防治研究仍主要集中在心、肝、脑、肾等重要脏器，对LIRI缺乏特异性治疗，疗效不稳定，对LIRI的分子病理机制亦尚未完全阐明。Ca2+超载及炎症反应是内脏重要器官缺血-再灌注损伤的重要病理机制。前期研究表明，活血化瘀类中药可调节钙调蛋白表达，减少LIRI骨骼肌细胞的凋亡[1]；同时研究发现，适量桃红四物汤（含0.075、0.15 g原药材/mL）预处理对LIRI大鼠骨骼肌具有保护作用，且呈量效关系，而浓度过高（含0.3 g原药材/mL）不仅未出现理想的量效关系，反而加重骨骼肌损伤[2]；体外细胞实验发现，经缺氧/复氧诱导损伤大鼠骨骼肌细胞，三磷酸肌醇受体（inositol triphosphate receptor，IP3R）表达显著上调，桃红四物汤预处理通过调控Wnt/Ca2+信号通路中Wnt5a/IP3R途径减轻腓肠肌成肌细胞损伤[3]，其中IP3R作为一种化学门控的Ca2+释放通道，其过度激活是诱发Ca2+超载，导致细胞凋亡的重要环节之一[4]。基于此，本研究制备大鼠LIRI模型，以IP3R上游信号分子Wnt5a阻滞剂作为阳性对照，观察桃红四物汤对大鼠LIRI骨骼肌IP3R表达的影响，进一步从Wnt5a/Ca2+信号通路角度探讨大鼠LIRI骨骼肌损伤机制及桃红四物汤的干预作用，为丰富LIRI的病理机制和防治方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD雄性大鼠80只，SPF级，2月龄，体质量（230±10）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002，动物使用许可证号SYXK（湘）2019-0002。饲养于湖南中医药大学实验动物中心无病原体设施，温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%，光照12 h，常规饲料喂养，自由饮水。

1.2 药物

桃红四物汤（桃仁15 g，红花15 g，熟地黄10 g，赤芍10 g，当归10 g，川芎10 g），湖南中医药大学第一附属医院制剂科结合现代工艺加工制成药液，规格250 mL/瓶，浓度0.15 g原药材/mL，批号20160408；FZR5，20 μg/mL，美国Sigma公司，批号20160206。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、抗IP3R抗体，艾博抗（上海）贸易有限公司，货号ab108517；Trizol，爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司，批号15596-026；DAPI，美国Sigma公司，批号023K1826；Rever Tra Ace®qPCR RT试剂盒，东洋纺上海生物科技有限公司，批号FSQ101；SYBR®Premix Ex TaqTM（perfect real-time）试剂盒，大连宝生物工程公司，批号DRR420A。7500实时PCR扩增仪（美国ABI公司），GL16M台式高速冷冻离心机（长沙科威实业），BD-180S双门冷冻柜（青岛海尔），NIS Elements F3.0软件（日本尼康）。

1.4 造模

采用课题组前期造模方法[5]，用塑料套管和市售橡皮筋阻断SD大鼠右后肢血流4 h，制备缺血-再灌注损伤模型。正常组大鼠不阻断血流。

1.5 分组和给药

将80只实验大鼠按随机数字表分为正常组、模型组、桃红四物汤组和阻滞剂组，每组20只。桃红四物汤组于造模前3 d开始给予桃红四物汤药液灌胃，2次/d，造模前2 h再给药1次，共7次，给药剂量根据体质量通过体表面积-剂量换算法计算得出，依据课题组前期动物实验结果，桃红四物汤中剂量（0.15 g原药材/mL）为最佳药效浓度[2]，即每只大鼠每日给药剂量为1 mL桃红四物汤药液＋3 mL蒸馏水；阻滞剂组造模前2 h腹腔注射1 mL FZR5；正常组和模型组大鼠同时点给予等体积蒸馏水灌胃。

1.6 取材

在缺血-再灌注0、2、4、8 h 4个时间点，各组随机选取5只大鼠，3%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定在自制手术台，沿右侧后肢长轴方向依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜，充分暴露腓肠肌肌腹组织，切取腓肠肌100 mg，冰盐水迅速洗净血液，滤纸吸干水分，剪刀切割剪碎后装入冻存管，置于-70 ℃冰箱保存。根据前期实验结果，HE染色、细胞凋亡及免疫组化检测只选择缺血-再灌注损伤后肢体损伤最严重的时点（8 h）进行检测。

1.7 HE染色

取大鼠部分腓肠肌组织，4%中性甲醛溶液固定，石蜡切片（厚4 μm），HE染色，切片均进行常规组织学评价。

1.8 DAPI荧光染色

取大鼠部分腓肠肌组织，DAPI荧光染色，激光共聚焦显微镜观察腓肠肌细胞凋亡，使用Image-Pro Plus version 6.0图像分析系统进行分析，每个样品取5个视野，计算凋亡指数（细胞核浓缩细胞数÷细胞总数×100%）。

1.9 免疫组化检测

取大鼠腓肠肌组织，多聚甲醛固定，切片，3%过氧化氢处理，并与10%山羊血清预孵育，然后与抗IP3R（1∶100）抗体4 ℃孵育，用HRP标记的IgG孵育样品，DAB进行显色反应，显微镜下观察显色过程，使用NIS Elements F3.0软件200倍光学显微镜下采集图像，用Image Pro Plus versionv 6.0单盲法检测阳性表达积分光密度（IOD值）。

1.10 RT-PCR检测

采用Trizol法提取腓肠肌总RNA，取约100 mg腓肠肌组织，加入Trizol溶液，加Oligo（dT）181 μL、5×M-MLV buffer 4 μL、总RNA 2 μL、M-MLV 1 μL，补水至20 μL体系，按照反转录酶说明书进行反转录，获得cDNA。PCR反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM（perfect real-time）试剂盒mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（引物序列见表1），补水至20 μL。PCR反应条件：按照SYBR®Premix Ex TaqTM（perfect real-time）试剂盒说明进行。采用相对定量PCR的方法，以GAPDH为内参，测定靶基因相对表达量，采用2−ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。ΔCt＝Ct目的基因－Ct内参基因，ΔΔCt＝ΔCt对照组－ΔCt样品组。

1.11 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，采用独立样本t检验对建模前后数据进行比较，多重比较用方差分析，再进行Fisher最小显著性差异检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 各基因PCR引物序列

2 结果

2.1 HE染色结果

正常组腓肠肌纤维呈长索状，肌纤维排列整齐，结构清晰，肌浆丰富，每一肌纤维内表面有多个紧密附着的细胞核，核大小、着色均匀，未见异常改变；模型组缺血-再灌注后肌纤维紊乱不规则，增厚、水肿，部分肌纤维完整，肌纤维间缝隙扩大，肌细胞破坏，明显炎性浸润；桃红四物汤组和阻滞剂组肌纤维轻度破坏，细胞受损肿大，排列尚整齐，肌纤维间缝隙稍扩大，炎性浸润不明显，较模型组减轻。见图1。

图1 各组大鼠腓肠肌形态（HE染色，×200）

2.2 DAPI荧光染色结果

正常组细胞核呈圆形或椭圆形状，核形完整，染色均匀；除正常组外，其余各组均可见凋亡小体，即核碎裂成大小不等的圆形小体，被细胞膜包绕，细胞核边缘不规则，细胞凋亡率明显高于正常组（P＜0.05），桃红四物汤组、阻滞剂组细胞着色较重，核出现浓缩、呈新月形聚集于核膜一边，但细胞凋亡率明显低于模型组（P＜0.05），桃红四物汤细胞凋亡率明显低于阻滞剂组（P＜0.05）。见图2、图3。

2.3 桃红四物汤对模型大鼠腓肠肌三磷酸肌醇受体蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠腓肠肌IP3R蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，桃红四物汤组、阻滞剂组大鼠腓肠肌IP3R蛋白表达显著下调（P＜0.05），桃红四物汤组与阻滞剂组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、图5。

2.4 桃红四物汤对模型大鼠腓肠肌三磷酸肌醇受体mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠各时点腓肠肌IP3R mRNA表达显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，桃红四物汤组、阻滞剂组大鼠再灌注0、2、4、8 h腓肠肌IP3R mRNA表达显著下调（P＜0.05），不同再灌注时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图2 各组大鼠腓肠肌细胞核形态（DAPI荧光染色，×200）

图3 各组大鼠腓肠肌细胞凋亡率比较（±s，每组5只）

图4 各组大鼠腓肠肌IP3R蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

图5 各组大鼠腓肠肌IP3R蛋白阳性表达比较（±s，每组5只）

表2 各组大鼠不同时间点腓肠肌IP3R mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠不同时间点腓肠肌IP3R mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 0 h 2 h 4 h 8 h 正常组 20 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13模型组 20 57.23±1.71*58.43±1.23* 62.16±0.73*59.74±1.75*桃红四物汤组 20 40.83±0.65#44.40±1.51# 48.60±0.93#46.20±0.84#阻滞剂组 20 40.72±1.59#44.20±1.07# 48.90±1.14#46.58±1.04#

3 讨论

LIRI对骨骼肌的影响是毁灭性的，生理解剖学研究表明，缺血3 h后即出现不可逆的肌细胞损伤，6 h时几乎完全消失[6-7]。目前较为一致的观点认为，LIRI可通过能量代谢障碍、氧应激和Ca2+超载导致骨骼肌细胞凋亡，其中Ca2+是介导细胞凋亡的重要第二信使[8-11]；骨骼肌细胞内游离Ca2+主要存在于肌浆网中，有IP3敏感和IP3不敏感两类钙池，分别由IP3R系统和兰尼啶受体系统控制，Wnt/Ca2+通路是一种Ca2+调节信号网络，该通路激活可上调IP3R的表达，从而诱导细胞Ca2+超载。

研究表明，桃红四物汤及其组方药物在缺血-再灌注损伤性疾病中治疗效果显著。红花提取物可通过调节Bax和Bcl-2基因表达起到对抗缺血-再灌注损伤时细胞凋亡的作用[12]。川芎有效成分川芎嗪在多个内脏器官的缺血-再灌注损伤中具有保护作用[13-14]。桃红四物汤可降低肢体缺血-再灌注损伤模型大鼠血清丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性，减少氧自由基产生，减轻过氧化损伤[2]。桃红四物汤可抑制脑缺血-再灌注损伤后大鼠大脑皮质神经元Caspase-3和p53的表达，从而减轻脑细胞凋亡[15]，在肾脏缺血-再灌注损伤方面，桃红四物汤通过抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠肾脏功能[16]。

本研究结果显示，桃红四物汤组、阻滞剂组细胞凋亡率和荧光强度明显低于模型组，提示阻滞剂、桃红四物汤预处理可减少细胞凋亡，从而达到减轻LIRI作用。RT-PCR和免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组IP3R蛋白和mRNA表达均上调，鉴于骨骼肌IP3R的化学门控Ca2+释放通道属性，该受体过度激活可诱导Ca2+超载从而开启细胞凋亡[17]，表明IP3R是LIRI中的关键蛋白；与模型组比较，阻滞剂组IP3R蛋白和mRNA表达均下调，表明IP3R是Wnt5a/Ca2+信号通路的下游分子，阻断该通路可调节IP3R表达；与模型组比较，桃红四物汤组IP3R蛋白和mRNA表达均下调，表明桃红四物汤预处理后可下调IP3R的表达而减轻LIRI，鉴于桃红四物汤组和阻滞剂组IP3R表达差异无统计学意义，表明桃红四物汤可通过调控Wnt5a/Ca2+信号途径下调IP3R的表达从而起到减轻LIRI作用，与本课题组体外实验研究结果一致[2]。这为LIRI骨骼肌细胞损伤的分子机制和桃红四物汤的防治作用提供了实验证据。本研究桃红四物汤组细胞凋亡率低于阻滞剂组，鉴于中药多环节、多途径、多靶点效应，以及G蛋白偶联受体信号转导系统的复杂性，同一配体可通过不同Wnt受体途径激活多条信号通路发挥不同效应，不同配体也可作用于同一受体发挥相同效应，各通路之间存在相互作用，最终形成复杂的Wnt蛋白质作用网络，Wnt5a是众多Wnt家族中的一员，桃红四物汤在Wnt5a/Ca2+信号通路中的具体作用靶点及是否还有其他信号途径介导LIRI，尚需今后进一步研究。