黄芪甲苷对脑缺血小鼠外周免疫抑制作用的影响

邹莹香，李世春，王志菲

1.上海中医药大学基础医学院，上海 201203； 2.上海中医药大学中西医结合研究院，上海 201203

脑卒中又称中风、脑血管意外，是由脑血管破裂或血管阻塞导致脑供血不足而引起脑组织损伤的急性脑血管疾病，可分为缺血性和出血性卒中。在我国，缺血性卒中发病率远高于出血性卒中，是国民致死和致残的主要原因之一[1]。据调查统计，85%脑卒中患者有并发症，其中23%～65%并发感染[2]，且多为外周免疫抑制所致[3]。脑卒中患者免疫抑制主要表现在脾脏明显萎缩，外周血中淋巴细胞数量减少、活化受损[4]。因此，逆转脑卒中后外周免疫抑制、减少并发感染可作为改善脑卒中患者预后的治疗手段。课题组前期通过大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型证实，补阳还五汤可抑制脑缺血后自然杀伤（NK）细胞向缺血脑区浸润、活化，改善脑缺血损伤；同时发现，补阳还五汤可增加脾脏和外周血中NK细胞比例，提示补阳还五汤可能具有改善脑缺血后外周免疫抑制的作用[5]。补阳还五汤以黄芪为君药，其主要有效成分黄芪甲苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[6]。因此，本实验以MCAO小鼠为模型，观察黄芪甲苷对脑缺血后外周免疫抑制的影响，为脑卒中治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠56只，体质量22～23 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（浙）2020-0002，动物使用许可证号SYXK（沪）2020-0009。饲养于上海中医药大学动物实验中心，本实验经上海中医药大学动物伦理委员会批准（PZSHUTCM18121409）。

1.2 药物及制备

黄芪甲苷对照品，上海同田生物技术有限公司，CAS：84687-43-4，纯度≥98%。称取适量黄芪甲苷对照品，用聚乙二醇、丙二醇、无水乙醇、PBS配制成浓度为4 mg/mL的黄芪甲苷溶液。

1.3 主要试剂与仪器

异氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，货号R510-22-4；TTC，德国Sigma公司，货号T8877；HBSS，生工生物工程（上海）股份有限公司，货号A003210；红细胞裂解液，上海碧云天，货号C3702；FITC标记抗小鼠NK1.1，美国BD Biosciences，货号553164；APC标记抗小鼠CD3，美国BioLegend，货号100236；PE标记抗小鼠NKG2D，美国BioLegend，货号115606；RPMI 1640培养基，美国Gibco，货号23400-021；BSA，德国BioFroxx，CAS：9048-46-8。动物呼吸麻醉机（美国哈佛仪器），多普勒血流仪（澳大利亚ADInstruments，Powerlab ML191），动物手术体温控制仪（美国哈佛仪器，K023986），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD Biosciences），离心机（德国Eppendorf，5810R）。

1.4 分组、造模和给药

将51只小鼠随机分为假手术组（13只）、模型组（20只）、给药组（18只）。参照文献[7]方法制备MCAO模型，使用呼吸麻醉机麻醉小鼠，体温控制仪监测小鼠肛温，温度控制在（37±0.5）℃，先后结扎小鼠颈总动脉和颈外动脉，从颈总动脉进线栓至颈内动脉阻断中动脉血流，假手术组仅结扎颈总动脉和颈外动脉。多普勒血流仪监控MCAO前后的血流值，将MCAO后血流值与MCAO前血流值比值保持在27%±0.5%。MCAO 45 min后，拔出线栓实现再灌注，给药组再灌注后按0.1 mL/10 g腹腔注射黄芪甲苷溶液，给药剂量40 mg/kg，12 h后再次腹腔注射给药1次，模型组和假手术组注射等量空白溶剂作为对照。

1.5 脑梗死体积测量

再灌注24 h后处死小鼠，将脑组织切成6个厚度1 mm脑片，放入2%TTC溶液，37 ℃水浴锅避光染色，染色完成后拍照，使用Image J软件测量每个脑片白色梗死区域面积，计算脑梗死体积（脑片梗死面积总和×脑片厚度）。

1.6 神经功能缺损评分

再灌注24 h后，采用改良的12点神经评分系统[8]对小鼠神经功能缺损情况进行评分，正常记0分，异常记1分，损伤越严重，总分越高。

1.7 脾脏和外周血自然杀伤细胞检测

1.7.1 脾脏及外周血淋巴细胞分离

再灌注24 h后测量小鼠体质量，眼球取血500 μL，处死后分离小鼠脾脏，称重，放入培养皿中，加入2 mL RPMI 1640培养基研磨，匀浆转移至15 mL离心管中，加入2 mL红细胞裂解液置于冰上裂解，轻轻摇晃，使其裂解充分，5 min后加等体积RPMI 1640培养基终止反应；4 ℃、350×g离心5 min，弃上清液，加入6 mL RPMI 1640培养基洗涤，离心；沉淀用1 mL HBSS重悬，进行计数细胞。外周血中加入4 mL红细胞裂解液，冰上裂解5 min（裂解步骤与脾脏相同）；4 ℃、300×g离心5 min，弃上清液，加入5 mL RPMI 1640培养基洗涤；4 ℃、250×g离心5 min；沉淀用1 mL HBSS重悬，进行细胞计数。

1.7.2 自然杀伤细胞标记及检测

取一定体积脾脏和外周血细胞悬液（含2×105个细胞），离心，100 μL 1%PBS稀释抗体（每106个细胞加0.5 μL NK1.1、2.5 μL CD3、1.25 μL NKG2D），重悬细胞后，冰上静置30 min，每管加入1 mL HBSS，4 ℃、4000 r/min离心6 min；弃去上清，沉淀加入300 μL HBSS重悬，使用流式管收集细胞，检测NK细胞占淋巴细胞的比例，并检测NK细胞活力。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。实验数据以—x±SE表示，多组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对模型小鼠脑梗死体积的影响

正常脑组织呈鲜红色，脑缺血损伤后脑组织呈白色。与假手术组比较，模型组小鼠脑组织明显变白，脑梗死体积明显增加（P＜0.001）；与模型组比较，给药组小鼠脑组织变红，脑梗死体积明显减少（P＜0.001）。结果见图1、表1。

图1 各组小鼠脑组织形态（TTC染色）

表1 各组小鼠脑梗死体积比较（—x±SE，mm3）

2.2 黄芪甲苷对模型小鼠神经功能缺损评分的影响

与假手术组比较，模型组小鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.001）；与模型组比较，给药组小鼠神经功能缺损评分明显降低（P＜0.001）。结果见表2。

表2 各组小鼠神经功能缺损评分比较（—x±SE，分）

2.3 黄芪甲苷对模型小鼠体质量和脾脏质量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠体质量和脾脏质量减轻（P＜0.001）；与模型组比较，给药组小鼠体质量和脾脏质量有所恢复（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组小鼠体质量和脾脏质量比较（—x±SE，g）

2.4 黄芪甲苷对模型小鼠脾脏和外周血自然杀伤细胞数量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脾脏和外周血NK细胞比例明显减少（P＜0.05，P＜0.001）；与模型组比较，给药组小鼠脾脏和外周血NK细胞比例明显增加（P＜0.05）。结果见表4、图2。

表4 各组小鼠脾脏和外周血NK细胞数量比较（—x±SE，%）

图2 各组小鼠脾脏和外周血NK细胞流式示意图

2.5 黄芪甲苷对模型小鼠脾脏和外周血自然杀伤细胞活力的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脾脏和外周血NKG2D表达明显降低（P＜0.001）；与模型组比较，给药组小鼠脾脏和外周血NKG2D表达明显升高（P＜0.001）。结果见表5、图3。

表5 各组小鼠脾脏和外周血NKG2D相对表达量比较（—x±SE，%）

图3 各组小鼠脾脏和外周血NKG2D流式细胞术示意图

3 讨论

脑缺血属中医学“中风”范畴，以突然昏仆、不省人事、言语不利、半身不遂为主症。黄芪具有补气升阳固表、生津养血消肿等功效[9]。黄芪甲苷是黄芪的代表性成分，研究表明其具有抗炎、抗凋亡[10-11]、促进神经生发[12-13]及血管新生[14]等作用，还具有免疫调节作用，防止中性粒细胞在脑缺血损伤大鼠脑内聚集[15]。

脑缺血后免疫反应分为2个阶段：第1个阶段是急性期，大量外周免疫细胞在不同时间浸润脑实质，这些免疫细胞既破坏神经结构，也促进组织修复[16]；第2个阶段即脑缺血由急性期向亚急性期发展阶段，也是本实验研究的外周免疫抑制阶段，这个阶段免疫系统由激活状态转变为抑制状态[4]，免疫抑制主要表现为淋巴器官萎缩、淋巴细胞减少及活化受损。研究显示，MCAO 22 h后，小鼠脾脏和胸腺组织明显缩小，脾脏红髓中的造血成分显著减少[17]。本研究发现，脑缺血损伤24 h后，小鼠脾脏明显萎缩，提示脑缺血导致外周免疫抑制的发生，黄芪甲苷给药后脾脏质量增加，表明黄芪甲苷可改善脑缺血后的免疫抑制。

另有动物实验表明，MCAO模型小鼠外周免疫器官及外周血中NK细胞、T细胞、B细胞等淋巴细胞数量减少[18]。NK细胞同时具有固有免疫和适应性免疫的特征[19]。一方面，在脑缺血损伤中，NK细胞是最早浸润入脑的免疫细胞之一，浸润的NK细胞可加剧神经元死亡，增加局部炎症及血脑屏障通透性，进一步加重脑梗死[20-21]；另一方面，卒中诱发的免疫抑制容易使患者并发感染，增加死亡风险，NK细胞通过清除感染细胞及产生干扰素-γ在宿主早期防御病原体中发挥关键作用[22]。本实验结果显示，脑缺血损伤后24 h，小鼠脾脏和外周血NK细胞比例下降，黄芪甲苷干预后，脾脏和外周血NK细胞比例升高，提示黄芪甲苷可改善脑缺血诱导的外周免疫抑制。NKG2D是NK细胞表面的激活性受体，在NK细胞活化中起重要作用。本研究结果显示，脑缺血损伤后24 h，小鼠脾脏及外周血NKG2D表达降低，黄芪甲苷可上调模型小鼠脾脏及外周血NKG2D的表达，提示黄芪甲苷可增加脑缺血后外周血中NK细胞活力。

综上，黄芪甲苷可增加脑缺血后脾脏和外周血NK细胞的数量和活力，改善脾脏萎缩，提示黄芪甲苷可能通过改善外周免疫抑制发挥保护脑缺血损伤的作用。本研究有助于了解中药单体成分在脑缺血损伤中的免疫调节作用及其可能的作用靶点，为脑卒中的临床治疗提供依据。